Приложение на генното инженерство в научните изследвания
- Генен нокаут
Да се изследва функцията на една или друга
За нокаут се синтезира същият ген или негов фрагмент, модифициран така, че генният продукт да загуби своята функция. Основни методи на изпълнение: цинков пръст, морфолино и ТАЛЕН.
За да се получат нокаутиращи мишки, полученитеГенетично конструираната конструкция се въвежда в ембрионални стволови клетки, където конструкцията претърпява соматична рекомбинация и замества нормалния ген, а променените клетки се имплантират в бластоцистата на сурогатната майка. При плодовата муха при голяма популация се инициират мутации на дрозофила, при които след това се търсят потомци с желаната мутация. Растенията и микроорганизмите се избиват по подобен начин.
- Изкуствен израз
Логично допълнение към нокаута еизкуствено изразяване, тоест добавяне на ген към тялото, което то не е имало преди. Тази техника за генно инженерство може да се използва и за изследване на функцията на гените. По същество процесът на въвеждане на допълнителни гени е същият като при нокаут, но съществуващите гени не се заменят или повреждат.
- Визуализация на генни продукти
Използва се, когато задачата е да се училокализация на генния продукт. Един от методите за маркиране е да се замени нормалният ген с такъв, слят с репортерен елемент, например с гена на зеления флуоресцентен протеин GFP. Този протеин, който флуоресцира в синя светлина, се използва за визуализиране на продукта от генетична модификация.
Въпреки че тази техника е удобна и полезна, нейните странични ефектипоследствията могат да бъдат частична или пълна загуба на функцията на изследвания протеин. По-сложен, макар и не толкова удобен метод е да се добавят към изследвания протеин не толкова големи олигопептиди, които могат да бъдат открити с помощта на специфични антитела.
- Изследване на механизма за изразяване
При такива експерименти задачата е да се проучиусловия на генна експресия. Експресионните характеристики зависят главно от малка част от ДНК, разположена пред кодиращия регион, наречен промотор, който служи за свързване на транскрипционни фактори.
Този сайт се въвежда в тялото чрез поставяне следвместо собствен репортерен ген, например GFP или ензим, който катализира лесно откриваема реакция. В допълнение към факта, че функционирането на промотора в определени тъкани в даден момент става ясно видимо, такива експерименти позволяват да се изследва структурата на промотора чрез премахване или добавяне на ДНК фрагменти към него, както и изкуствено да се подобри неговата функции.
Защо е необходимо човешко генно инженерство?
Когато се прилага върху хората, генното инженерство би моглоизползва се за лечение на наследствени заболявания. Технически обаче има значителна разлика между лечението на самия пациент и модифицирането на генома на неговото потомство.
Задачата за промяна на генома на възрастнияе малко по-сложно от отглеждането на нови генетично модифицирани породи животни, тъй като в този случай е необходимо да се промени геномът на множество клетки на вече оформен организъм, а не само на едно ембрионално яйце. За да направите това, се предлага да се използват вирусни частици като вектор.
Вирусните частици могат да проникнат взначителен процент възрастни клетки, вграждащи своята наследствена информация в тях; възможно е контролирано възпроизвеждане на вирусни частици в организма. В същото време, за да намалят страничните ефекти, учените се опитват да избегнат въвеждането на генетично модифицирана ДНК в клетките на гениталните органи, като по този начин избягват въздействието върху бъдещите потомци на пациента.
Също така си струва да се отбележи значителната критика на тази технология в медиите: развитието на генетично модифицирани вируси се възприема от мнозина като заплаха за цялото човечество.
С помощта на генната терапия е възможно в бъдеще да се промени човешкият геном. Понастоящем ефективните методи за модифициране на човешкия геном са на етап разработка и тестване върху примати.
Дългогодишно генно инженерство на маймунисе сблъска със сериозни трудности, но през 2009 г. експериментите бяха увенчани с успех: в списание Nature се появи публикация за успешното използване на генно модифицирани вирусни вектори за излекуване на възрастна мъжка маймуна от цветна слепота.През същата година първият генетично модифициран примат (отгледано от модифицирано яйце) роди потомство - обикновена мармозетка (Калитрикс джак).
Макар и в малък мащаб, генното инженерство вечесе използва, за да даде шанс на жени с определени видове безплодие да забременеят. За това се използват яйцеклетки от здрава жена. В резултат на това детето наследява генотипа от един баща и две майки.
Възможността за въвеждане обаче е по-значимапромените в човешкия геном са изправени пред редица сериозни етични проблеми. През 2016 г. група учени в САЩ получи одобрение за клинични изпитвания на метод за лечение на рак, използващ собствените имунни клетки на пациента, които са генетично модифицирани с помощта на технологията CRISPR / Cas9.
В края на 2018 г. в Китай се родиха две деца,чийто геном е изкуствено променен (генът CCR5 е изключен) в ембрионален стадий с помощта на метода CRISPR/Cas9, като част от изследвания, провеждани от 2016 г. за борба с ХИВ. Единият от родителите (бащата) е бил заразен с ХИВ, а децата, според изявлението, са родени здрави.
Тъй като експериментът беше неразрешен (предиСледователно всички подобни експерименти върху човешки ембриони са били разрешени само в ранните етапи на развитие с последващо унищожаване на експерименталния материал, тоест без имплантиране на ембриона в матката и раждане на деца), ученият, отговорен за това, не предоставя доказателства за своите твърдения, които бяха направени на международна конференция за редактиране на генома.
В края на януари 2019 г. китайските власти официално потвърдиха фактите от този експеримент. Междувременно на учения му беше забранено да се занимава с научна дейност и той беше арестуван.
Как се редактира човешкият геном?
- Метод с цинкови пръсти
"Цинкови пръсти" също се намират в съставачовешки протеини. Благодарение на този метод е възможно да се проектира ZFN верига, така че тя да разпознава специфичен участък от ДНК. Това прави възможно насочването към определени области в рамките на сложни геноми.
Домейни с цинков пръст се намират вчовешки транскрипционни фактори - протеини, които регулират процеса на синтез на РНК с ДНК матрицата. При създаването на изкуствени нуклеази е възможно да се изгради верига от „цинкови пръсти“, така че да разпознава определен участък от ДНК.
Ако такава верига е достатъчно дълга, тяможе да разпознае относително разширени ДНК последователности, състоящи се от множество тринуклеотидни фрагменти. Това означава реална възможност за целенасочено въздействие върху специфични области в рамките на големи сложни геноми.
Разкри обаче и методът „цинков пръст“.сериозни недостатъци: първо, това не е много стриктно разпознаване на тринуклеотидни повторения, което води до забележим брой разцепвания на ДНК в „нецелеви“ региони.
На второ място, методът се оказа много трудоемък искъпо, тъй като за всяка ДНК последователност е необходимо да се създаде собствена оптимизирана протеинова структура на цинк-пръстовите нуклеази. Следователно системата „цинкови пръсти“ не е широко разпространена.
- ТАЛЕН
През 2011 г. списанието Nature Methods наименува систематаTALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) „метод на годината“ поради широк спектър от възможни приложения в различни области на фундаменталната и приложната наука.
TALEN е един от методите за насочено приложениепробив в ДНК с последващото й „излекуване“ - за изключване на гени при мишки. Веднага след тях тази технология се използва за въвеждане на мутация в генома на мишката, което води до развитието на един от наследствените синдроми. Авторите на метода за моделиране на генетично обусловени заболявания са успели не само да „развалят“ генома на мишката, но и да го коригират обратно.
- CRISPR / Cas9
Методът осигурява точен ефект върху определени ДНК области и може да се използва в почти всяка съвременна молекулярна биологична лаборатория.
Тази система се базира на специални областибактериална ДНК - CRISPR (Клъстерирани редовно разпръснати къси палиндромни повторения или кратки палиндромни клъстерни повторения). Тези повторения са разделени с дистанционни елементи - къси фрагменти от чужда ДНК. Последните се включват в генома, след като ДНК се рекомбинира с неговия геном.
Примери за редактиране на хора
- Редактиране на генома точно в тялото
Болест на 44-годишния жител на Аризона БрайънМадо се проявява в ранното детство. Той е нелечим и се наследява предимно от мъже. Мукополизахаридозата тип II е метаболитно разстройство: хората с него имат мутация в ген, отговорен за производството на ензим, който участва в разграждането на сложни въглехидрати. В резултат на това те се натрупват в клетките и причиняват множество патологии на органи.
Човекът реши да участва в клиничнататестване на нов метод – генна терапия. Това е само първата фаза на изследването и преди регистрацията на терапията (т.е. преди разрешението за използване на този метод за всички пациенти със синдром на Хънтър) трябва да има три от тях.
Методът, използван в случая на БраянMado ви позволява да редактирате генома директно в човешкото тяло - и в същото време точно да се насочите към определен участък от ДНК. Редактирането става с помощта на така наречените „цинкови пръсти“.
- Генетично модифицирани деца
Китайският изследовател He Jiankui редактира геномите на човешки ембриони преди ин витро оплождане, в резултат на което две деца са с променена ДНК.
Изследовател на системата CRISPR / Cas9редактира геномите на седем двойки ембриони по време на репродуктивно лечение. В резултат на една от бременностите две близначки с променена ДНК са родени от здрава майка и ХИВ-инфектиран баща. Той Jiankui обясни, че е премахнал гена CCR5 от деца, което им е дало доживотен имунитет срещу ХИВ.
- Завръщащо се зрение с генна терапия
За възстановяване на зрението могат да се използват оптогенетични технологии, с помощта на които работата на невроните може да се контролира с помощта на чувствителни към светлина протеини на бактерии и лазерни светкавици.
Водени от тази идея, биолозите са създали вирус,които могат да проникнат в ганглиозните неврони. Тези нервни клетки са отговорни за предаването на сигнали от ретината към човешкия мозък. Веднъж попаднал в ганглиозната невроза, вирусът го кара да произвежда подобни сигнални молекули. Тази процедура обаче не възстановява зрението сама по себе си, тъй като протеините на бактериите реагират на светлината по различен начин от пръчките и конусите на ретината.
За да реши този проблем, професорът от БазелУниверситетът Botond Rosca и професорът от Университета в Питсбърг Хосе Сахел са създали специални очила, които трансформират постъпващото изображение във формат, разбираем за мозъка и стимулират ганглийните клетки с лазерни светкавици. В резултат на това пациентът може да вижда силуетите на големи предмети и предмети и да извършва други сложни действия.
Прочетете още:
Учените са тествали теорията за панспермията на тарсигради: те могат да пътуват в космоса
Учените са открили, че супер обогатеното злато се образува като кисело мляко
Малкият водороден двигател замества аналозите за изкопаеми горива