Лабораторията по масспектрометрия на Skoltech се ръководи от член-кореспондент на Руската академия на науките
Какво лежи в основата на изграждането на жизнени процеси
ДНК е дълга полимерна верига, която съхранява информация за това как тялото трябва да изглежда и функционира.Тоест по какво се различаваме от другите видовеи как два индивида от един и същи вид се различават един от друг. Тези молекули определят нашата уникалност. Нека ви дам пример: гъсеница и пеперудата, в която тя расте. Мислите ли, че техните ДНК молекули са различни или еднакви? Всъщност верният отговор е: същото. Генетичната информация не се променя по никакъв начин през живота. Всъщност, защо в крайна сметка гъсениците и пеперудите са различни? Защото не цялата информация, съхранявана в ДНК, се реализира едновременно. Внедряването става чрез процеса на транскрипция, в резултат на което след прочитане на отделни гени информационната РНК позволява синтеза на протеини.
Протеините са универсални молекулярни машини в нашето тяло, които изпълняват различни функции: от строителни до регулаторни.Едно от остарелите определения за живота еподредено съществуване и взаимодействие на протеинови молекули. Но проблемът е, че протеиновите молекули също са големи. Протеините също са полимерни молекули с голямо молекулно тегло: обикновено от 10 до няколкостотин килодалтона. И изграждането на основни жизнени процеси върху тях е доста проблематично, тъй като те са доста чувствителни към промените в температурата и външната среда. И вероятно затова почти всички жизнени процеси в клетката се осъществяват чрез малки молекули. А превръщането на малките молекули една в друга вече се контролира от протеини. Молекулното тегло на тези малки молекули е от няколко десетки до няколкостотин килодалтона. Всички малки молекули, които се намират в живия организъм, се наричат метаболити.
1 далтон или 1 атомна единица маса (amu)- извънсистемна единица за маса, използвана за масите на молекули, атоми, атомни ядра и елементарни частици.
1 а. единици = 1,660 539 066 60 (50) ⋅10−27 кг.
Първичните метаболити са химикали, които се намират във всички клетки на тялото и са необходими за поддържането на жизнените процеси.Всички полимерни молекули, протеини инуклеинова киселина. Тези метаболити са еднакви за всички клетки на един организъм. По време на живота метаболитите се превръщат един в друг, например с цел пренос на енергия. И тези трансформационни пътища - трансформационни вериги - се наричат метаболитни пътища.
Цикълът на Кребс или цикълът на трикарбоксилната киселина е отговорен за процеса на клетъчно дишане.
Различните метаболитни пътища в човешкото тяло се пресичат, тоест те имат общи участници.По този начин всички процеси, които се случват с метаболитите, са взаимосвързани.
Вторичните метаболити са вещества, които не са необходими на всички клетки за осигуряване на жизнените им функции.Те обикновено се използват за адаптиране към условиятавъншна среда. Например кафеените растения произвеждат кофеин, за да предпазят листата си от вредители. Те са токсични за бръмбарите, които ядат листата на кафеените растения. Но ако по някакъв начин премахнем целия кофеин от растението, то ще продължи да живее. Никакви жизненоважни процеси няма да бъдат нарушени. Вторият пример са антибиотиците. Знаете, че пеницилинът е първият антибиотик и то напълно случайно изолиран от плесени, което направи революция в медицината. Плесените използват пеницилин, за да изчистят жизненото си пространство. Той е безвреден за родителския организъм, но е токсичен за други микроорганизми. Всъщност хората използват това свойство за лечение на различни бактериални инфекции. Поради факта, че хората активно консумират растения като храна, тялото ни е гъсто населено с различни микроорганизми, които образуват микрофлора. Тези вещества са вторични метаболити не само на самия човек, но и на живи организми, които неизбежно влизат в тялото ни.
Естественият филтър и защо не е наред
Ксенометаболитите са антибиотици, съединения, които не са свързани с дейността на живите организми.Обикновено е нещо, което човек е получилизкуствено за различни цели. Например лекарства, хранителни добавки, хранителни добавки, допинг, наркотици, продукти от изгаряне на тютюн, алкохол или хигиенни продукти, битова химия, екотоксиканти. Това също са малки молекули и те влизат в тялото както умишлено, в случая с лекарствата, така и случайно. Например, измили сте зъбите си, погълнали сте паста за зъби - и ето как новите химикали са влезли във вашата система. И много от тези вещества могат да имат определени ефекти върху тялото ни, дори в много малки концентрации. Освен това този ефект може да бъде положителен или отрицателен или да варира в зависимост от количеството на това вещество.
Черният дроб е първата бариера за навлизането на чужди химикали в системната циркулация.Опитва се да филтрира молекули, коитотялото ще бъде увредено и ще ги премахне, предотвратявайки по-нататъшното им освобождаване през кръвния поток в органите. Черният дроб има много механизми за филтриране, но нито един от тях не работи на 100%: в противен случай нямаше да има отравяне и сериозни последици от приемането на каквито и да е токсини или лекарства. Черният дроб обаче се възползва от факта, че нашето тяло е до голяма степен вода, тоест то се състои от 80 процента вода. Следователно черният дроб се опитва да сортира молекулите на хидрофилни, които се разтварят във вода, и хидрофобни. Черният дроб „вярва“, че ако веществото е хидрофилно, то може да бъде допълнително освободено в системния кръвен поток, тъй като не би трябвало да причини много вреда. И ако веществото е хидрофобно, тогава трябва да се направи нещо с него, за да се предотврати по-нататъшното му освобождаване или поне да стане по-хидрофилно.
Черният дроб има два механизма – метаболитни фази.В първата фаза черният дроб се опитва даспециални протеини и ензими от семейството на цитохром Р450 окисляват тези вещества. В резултат на окисляването структурата на молекулата се променя и тя може да стане по-хидрофилна. След това черният дроб може да освободи тези метаболити в кръвта или да се опита да ги отстрани през бъбреците чрез урината или през червата. Ако това не работи, черният дроб може да "зашие" готови, гарантирано водоразтворими молекули върху тези окислени молекули.
Чернодробният метаболизъм увеличава разнообразието от малки молекули, които могат да попаднат в телата ни.Например на етапа на окисление от една молекула теоретично се образуват повече от 500 различни други други молекули; не е възможно да се предвиди коя от тях се образува и коя не.
Безкрайната азбука: Защо е толкова трудно да се изследват метаболитите
Нуклеиновите киселини могат да бъдат представени като петбуквена азбука, от която е изграден голям текстов низ.Да, разбира се, последователността от букви в товалинията може да бъде относително хаотична, въпреки че по време на живота ДНК не се променя, а просто се копира. Така че имаме определени ограничения за това какъв ще бъде този низ. В случая с протеините ситуацията е малко по-сложна: вече ще има 20 букви в азбуката, тоест 20 аминокиселини, от които са изградени протеините, но това също се случва неволно. Следователно, от гледна точка на изследователя, тези обекти също са доста сходни един с друг. А в случая с метаболитите е изключително проблематично да се отдели всяка азбука: всъщност това е цялата периодична таблица. А сред правилата за образуване - само правилото за валентността. В допълнение, има характеристика на въглеродната химия, която позволява на два въглеродни атома да се свързват един с друг и след това впоследствие да добавят неограничен брой въглеродни атоми или други атоми от периодичната таблица, което води до огромно химично разнообразие от такива молекули.
За изследване на такива малки молекули и цялото им разнообразие са необходими специални методи.Има прости:например органолептичен анализ, с който се е сблъсквал всеки, който е направил общ тест за кръв или урина и е видял, че в посоката има линия „мирис, цвят“. Когато е необходимо да се намери конкретна молекула в разтвор, се добавя капка от предварително избран реагент. Ако в разтвора е имало молекула, ще се получи оцветяване; ако не е имало, ще се появи само утайка. Сред простите методи има и оптична спектроскопия, когато можете да използвате микроскоп, за да направите изводи от структурата на утайката. Доста популярни сега са имунохимичните методи: това е същият тест ELISA за COVID-19.
Проучванията Omics са тези изследвания, които изучават пълна популация.А метаболомиката предполага анализ на големиданни, които представляват пълния набор от малки молекули в организъм, клетка или орган. Наборът от тези данни варира според различни оценки от няколко хиляди, ако разглеждаме само първичните метаболити, до няколко десетки хиляди, ако към тях добавим вторични метаболити на известни растения, бактерии и гъби. Всъщност до няколкостотин милиона, ако вземем предвид цялото химическо разнообразие, което може да попадне в човешкото тяло. И за тяхното изучаване са необходими специални методи: ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) спектроскопия и масспектрометрия.
През 80-годишната история на ЯМР учените, участващи в този метод, са получили пет Нобелови награди.Четири - за ЯМР, а петият - замагнитен резонанс. Метод, малко по-различен от ЯМР спектроскопията, но много подобен по принцип. ЯМР методът се основава на факта, че някои атоми в периодичната таблица имат ненулев магнитен момент. Те са малки магнити и могат да взаимодействат с външно магнитно поле. Това взаимодействие се проявява в разделянето на енергийните нива. Методът на ЯМР позволява да се прави разлика между различни атоми и атоми на един и същ елемент, но в различни среди. Напоследък ЯМР губи популярност, главно поради високата си цена.
Как да направим заредени частици от сложна смес и да разберем техния състав
Мас спектрометрията е метод за разделяне на заредени частици чрез взаимодействие с електромагнитно поле.Ако вземем някаква сложна смес, състояща се отразлични заредени частици и почти всяка молекула със съвременни методи на масова спектрометрия може да бъде превърната в заредена форма чрез добавяне на протон към нея или премахване на протон от нея и прилагане на електромагнитно поле към тази смес, тогава частиците в това поле ще започнат да се движат и те ще имат или скорост, или траектория в зависимост от масата. Леките частици ще пристигнат в детектора по-рано от тежките. След обработка на данните от детектора се получава масов спектър, в който по оста Y ще има интензитет на сигнала, който е пропорционален на броя на йоните, а по оста X - масата в йоните, или по-скоро, съотношението на маса към заряд. Освен това масспектрометрията ви позволява да измервате масата с много висока точност. Това означава, че е възможно недвусмислено да се установи елементният състав на йона, заредените частици или молекулата, от които е образуван. Математически това се нарича решаване на диофантовото уравнение в цели числа: всъщност това е селекция от коефициенти близо до всеки атом: m(C), m(H), k(O), z(N). И само една комбинация от цели числа m, n, k, z може да даде масата, измерена от масспектрометъра.
Методът на масова спектрометрия е предложен в началото на ХХ век от Томпсън.Учените сглобиха първия в света масспектрометър ис негова помощ прави голямо откритие: експериментално потвърждава съществуването на изотопи. От друга страна, той не успя да даде правилна интерпретация на резултатите си. Неговият ученик Уилям Астън направи това за него: през 1922 г. той получи Нобелова награда за това откритие. През 20-ти век, поради поредица от световни войни, масспектрометрията се развива като метод за военните. В началото на своето развитие той намира основно приложение в ядрената индустрия. Тъй като масспектрометрията може да разделя веществата по маса и да определя изотопи, тя може да се използва за разделяне на изотопи като уран. Още две Нобелови награди бяха присъдени за масспектрометрия: през 1989 г. - Волфганг Паул и Ханс Демелт, а след това през 2002 г. - истинска революция беше извършена независимо от Джон Фен и Каиши Танака. Те предложиха свой собствен метод, който дава възможност да се получи заредена частица от голяма полимерна молекула: от протеини или от нуклеинови киселини, без да се разрушава. Това даде тласък на изследването. Сега нито една лаборатория - биохимична или молекулярно-биологична - не може да работи без собствен масспектрометър или без добре оборудван център за споделено ползване в института.
След като определим масата на йон, можем да определим само елементарния състав, но не и структурата на молекулите.Защото един елементарен състав от различни структури може да съответства на огромно число. Тоест атомите в една молекула могат да бъдат подредени по различни начини. Това се нарича явление изомерия.
Масспектрометристите са измислили метод, който ви позволява да получите малко повече информация за структурата на молекулата: определено препятствие е поставено по пътя на летящите ускорени молекули.Обикновено това са газови молекули.Когато молекулите се сблъскат с тези газови молекули, те могат да се разпаднат от сблъсъка. И тогава масспектрометърът измерва масата не на оригиналната молекула, а на парчетата, на които се е разпаднала. И това разпадане не става произволно, а покрай най-слабите връзки в молекулата. Получените фрагменти са идентични и представляват молекулярни отпечатъци: уникални за всяка молекула.
Хроматографията е метод за разделяне на вещества, базиран на тяхното взаимодействие със сорбенти.Сорбентите са нещо, което може да абсорбирадруги химикали, а най-простият е активен въглен, който приемаме при отравяне. В началото на 20-ти век руският учен Михаил Цвет демонстрира, че ако такова естествено багрило се прекара през колона, пълна с тебешир, тогава вместо едно голямо зелено намазано петно ще получите няколко многоцветни петна: от жълто до зелено. Така той първо разбра, че зелената боя от листата е смес от различни вещества. И второ, той открива хроматографията, за която през 1952 г. други учени, които довеждат неговия метод до някаква съвременна форма, получават Нобелова награда. В съвременната хроматография сместа преминава през колона с помощта на течност или газ, в зависимост от вида на хроматографията. Течността „влачи” молекулите напред, към изхода на колоната, а сорбентът пречи на всяка молекула по различен начин. В крайна сметка те напускат колоната по различно време, което може да бъде записано и използвано като друг пръстов отпечатък за идентификация.
От изследване на цереброспиналната течност до метод за суха кръв
Масова спектрометрия е единственият метод, който понастоящем се използва за изследване на цереброспиналната течност.В някои трудни за диагностика случаизаболявания се налага пункция, пробиване на гръбнака и вземане на проба от ликвор. Но проблемът е, че средно човек има само 120 ml цереброспинална течност. А тази течност е под налягане, така че приемът дори на 1 мл значително повлиява това налягане и може да доведе до необратими последици за организма. Следователно в действителност могат да се вземат проби само от няколко микролитра. Нито един от съществуващите методи освен масспектрометрията не може да се справи с толкова малки количества проби, защото колкото по-малка е пробата, толкова по-малко молекули има и толкова по-чувствително трябва да бъде вашето оборудване. Чувствителността на масспектрометрията обикновено е достатъчна за това. След събирането пробата се отстранява от механични включвания и протеини, за да се избегнат повреди на оборудването. След анализ резултатът се обработва с компютър и се получава „списък с функции“: изходът е приблизително 10–15 хиляди реда. Колоните създават формула, която дефинираме с точна маса, интензитет, който е пропорционален на количеството на тази молекула, и „пръстов отпечатък“.
Най-директният метод за прилагане на товаметаболомичен експеримент с масспектрометрия - сравняване на болни и здрави хора, за да се определи кои молекули се появяват, появяват се и променят концентрацията си, когато възникне такава разлика.Обикновено има две групи:здрави хора и хора с интересно за нас заболяване, например със специфична форма на онкология. За всяка проба се получават такива плочи, след което математиците ги сравняват и визуализират, за да намерят разлики между тях.
Първото приложение на масова спектрометрия е при неонатален скрининг.Всяко новородено, със заповед на Министерството на здравеопазването с2006 г., от тях се изисква да се изследват за определен набор от наследствени заболявания. Сега, така или иначе, в Москва правят тестове за поне 16 различни заболявания. Има такива заболявания и те често се проявяват от първите минути на живота, които, ако не бъдат спрени навреме, след седмица или няколко дни могат да направят детето инвалид за цял живот. Следователно такава диагностика трябва да се направи в рамките на първите няколко часа от живота на новороденото. Биомаркерите на почти всички тези заболявания са метаболити с малка молекула. Това означава, че болестите се проявяват под формата на нарушения в метаболизма, например натрупване на определени органични киселини в кръвта или определени липиди. И, естествено, това натрупване се случва в много малки концентрации; необходимо е да се разпознае разликата в метаболизма. Следователно, освен масспектрометрията, никой друг метод няма да работи тук.
За да решат проблема със събирането на кръв от деца (не толкова голямо количество кръв и страх на децата от инвазивни методи и лекари), те излязоха с технология за анализ на изсъхнали петна от кръв.Прави се малка пункция и една или повечедве капки кръв директно върху малко парче филтърна хартия. Обемът на кръвта тук е няколко микролитра. След това тази карта се изсушава и се изпраща в лабораторията, като изпращането също е много удобно: не е необходимо пробата да се замразява или размразява. Просто разтворете отново тази карта за анализ и след няколко часа анализът е готов.
Друга област на приложение за масова спектрометрия е персонализираната медицина.Всичките ни вещества отиват в черния дроб и черния дробпо някакъв начин ги метаболизира. Освен това черният ни дроб работи по различен начин за всички нас, не само поради някакви заболявания или лоши навици. Например, сокът от грейпфрут може значително да повлияе на вашия метаболизъм; в резултат на това концентрацията на някои лекарства може да бъде няколко пъти по-висока от очакваната. Някои хора ще имат тази концентрация в кръвта си след приема на лекарството, докато други ще имат два пъти по-висока концентрация. Оказва се, че дозата трябва да бъде намалена наполовина, за да не нанесете ненужна вреда на тялото. Оттук и преминаването към персонализирана медицина. Вземете хапче, кръвта ви се взема на всеки час и те гледат кривата: как веществото преминава през тялото ви във времето, каква е концентрацията му в кръвта. Тогава лекарят може да коригира дозата или дори да спре приема на лекарството и да предпише друго. И в този случай анализът на суха кръв също се използва много активно.
Всяко ново лекарство, което излиза на пазара, задължително преминава през етап на метаболитно изследване.Някои лекарства може да не са много токсични,но в резултат на разрушаване в черния дроб и някои грешки, тези вещества могат да се превърнат в още по-токсични. Най-простият пример е парацетамолът. В инструкциите за парацетамол пише, че не трябва да се дава на малки деца. Че на малките деца трябва да се дава само ибупрофен. И причината за това е натрупването на тази молекула в черния дроб, която в резултат на метаболизма има токсичен ефект. За възрастен с добре развит черен дроб този токсичен ефект не е много забележим, въпреки че, разбира се, не трябва да поглъщате парацетамол в буркани. За малките деца това всъщност може да доведе до всякакви неприятни и дори необратими последици. Следователно всяко ново лекарство трябва да се изследва за метаболизъм.
Образът е начин на провежданемасспектрометричен анализ, когато получаваме информация не само за хомогенна, но и за хетерогенна проба и можем да изследваме нейния молекулен състав в космоса.Има толкова интересен пример за изучаванеразпределение на лекарството и неговите метаболити в тялото на плъха. Експериментът се провежда по следния начин: на плъх се дава определено лекарство, след няколко часа животното се евтаназира и след това животното се нарязва фино по цялото тяло. И тогава специална техника на масова спектрометрия ви позволява да изследвате молекулярния състав на всяка точка в тази проба. След компютърна обработка е възможно да се визуализира къде кои метаболити са се натрупали. Важно е да се проучи разпределението на метаболитите, защото ако приемате лекарство за пневмония, важно е то да попадне в белите дробове, а не в мозъка. Масспектрометричният скалпел е „нож“, който изпомпва молекули от мястото на разреза и след това, използвайки компютърна технология, е възможно да се определи кой хирург реже тъканта: болен или здрав. Сега този метод се прилага в САЩ и вече е извършена първата реална операция с такъв нож.
Отпечатъци за всяка молекула
Проблемът е, че няколко стотици или дори хиляди химични съединения могат да съответстват на един елементарен състав.Следователно е необходимо да се идентифицират всички редоветаблици и това е основната задача на съвременния метаболомичен анализ, за съжаление, тя не е напълно решена. Молекулярните пръстови отпечатъци се сравняват с тези, открити в бази данни на химически молекули. Ако те съвпадат, тогава можем да кажем с известна увереност, че това е правилната молекула. Но такива бази данни съдържат много ограничен брой вещества. Пълната база данни с пръстови отпечатъци съдържа около 20-30 хиляди съединения; тя дори не обхваща всички първични и вторични метаболити, които присъстват в човешкото тяло. Има и друг проблем: за да попълните тази база данни, имате нужда от чисто химическо вещество, а те обикновено са скъпи. Това означава, че един чист химикал обикновено струва няколко десетки или стотици долари.
Един подход за идентификация е създаването на нови пръстови отпечатъци.Например, сега методът се развива активноспектрометрия на подвижността на йони. Докато масспектрометрията разделя йоните по маса, подвижността на йоните им позволява да бъдат разделени по размер. Тоест, ако имате двама бегачи - не тежък и лек, а голям и малък, и поставите някакво препятствие по пътя им - например мрежа с клетки, тогава тънък спортист ще бързо да пропълзи през тази мрежа и да стигне до финалната линия, но един дебел ще Докато не излезе от тази мрежа, той ще изтича след известно време.
Вторият метод е да се опитаме да намерим пръстови отпечатъци, които не изискват чисти стандарти за идентифициране.В лабораторията предлагаме да използваме така наречения изотопен обмен.
Например, ако разгледаме такава молекула, тогаваще видим, че има водородни атоми, свързани с кислорода. Така че, те са специални. Те могат да напуснат тази молекула и да се върнат към нея. Ако имаме тази молекула разтворена във вода, тогава водородът може да напусне молекулата и водородът да се върне от водата. И ако вземем не само вода, но тежка вода, където вместо водород има деутерий, тогава водородът може да напусне молекулата, а деутерият да заеме неговото място. Известно е, че деутерият се различава от водорода по молекулно тегло на единица и масов спектрометър може да забележи такова изместване. Просто като преброим броя на такива водороди, може да се каже дали това е необходима или ненужна молекула, независимо дали сме я идентифицирали правилно или не.
Изкуственият интелект може да се използва за идентифициране на молекули.Въз основа на наличната информация можете да завършитебази данни с липсваща информация, използвайки методи за дълбоко обучение. Тоест, ние обучаваме модела и той предсказва необходимите пръстови отпечатъци въз основа на структурата на молекулата, която след това можем да използваме, за да сравним с полученото в експеримента.
Вижте също:
Уран е получил статута на най-странната планета в Слънчевата система. Защо?
Хората могат да издържат на много ниски температури дори без източници на топлина
Физиците са създали аналог на черна дупка и са потвърдили теорията на Хокинг. Къде води?