Dmitrij Madera, vedoucí Oddělení molekulární genetiky BIOCAD, odborný asistent na SPCFU, Ph.D.
V roce 2002 absolvoval biologickou fakultu Moskevské státní univerzityobor genetika. Obhájil diplomovou práci pro doktora fylosofie v biologii o programu studia funkce a genové exprese na University of Massachusetts, poté pracoval na Národních ústavech zdraví, studoval molekulární aspekty vývoje rakoviny a jak je ovlivnit. V roce 2015 vedl laboratoř molekulární genetiky na BIOCADu a od té doby se zabývá vývojem produktů genové terapie. Je autorem mezinárodního patentu popisujícího novou nukleázu rodiny Cas9 a článků v oblasti vývoje rakoviny.
Experiment Jiankui, onkologické riziko u narozených dívek a cílové mutace
Co si myslíte o experimentu čínského biofyzika Che Ťien-kchueje, který upravil genom dvou embryí?Expertinárokže narozené dívky mohou mít mutace. Jak tomu zabránit?— Po prostudování původního zdroje (studie MIT — Hi-Tech) a komentáře genetika Fjodora Urnova jsem si uvědomil, že média jsou trochu zkreslenáAno, u dívek je větší pravděpodobnost, že budou mít mutace.To se týká těch mutací, u kterých není známo, kde přesně vzniknou.A nyní je obtížné přesně určit, kde náhodné mutace, které jsou výsledkem CRISPR/Cas9, vznikly.Chcete-li to provést, musíte provést srovnání s rodiči dívek.
Formálně je to správné tvrzení: skutečně mohou existovat cílené mutace a nedá se s tím nic dělat.A současné metody úpravy genů tomu nebrání.být nebezpečný.
Na konci roku 2018 čínský vědec He Jiankuioznámil, že byl schopen vytvořit geneticky modifikované dvojčata s vrozenou imunitou vůči HIV. Řekl, že editoval embrya párů podstupujících IVF a jeden ze sedmi pokusů byl úspěšný. Experiment spustil novou vlnu diskusí o etice zasahování do lidského genetického kódu.
Fedor Urnov, specialista na úpravyGenom University of California v rozhovoru s MIT Technology Review poznamenal: „Tvrzení, že reprodukoval převládající CCR5, je očividným zkreslením,“ a dodal, že to lze označit pouze jako „úmyslné zkreslení“.
Nová studie od MIT ukázala, že to vědci nebyli schopni reprodukovat převládající verzi CCR5. Přestože se tým zaměřil na správný gen, vědci nekopírovali požadovanou variantu Delta 32, ale místo toho vytvořili nová vydání, jejichž účinek není jasný - zatímco mohou způsobit mutace.
Tvrzení, že Che Ťien-kchuej nebyl schopen zmutovat gen CCR5 (gen, který umožňujeSkutečně dosáhl svého cíle a CCR5 byl skutečně zmutován a již nefunguje, což znamená, že HIV nemůže infikovat lidské buňky.Ano, zřejmě se mu nepodařilo replikovat specifickou přirozenou alelu, která se nachází v lidských populacích, ale přesto je CCR5 "vyřazena" a nefunguje, což znamená, že Jiankui dosáhl minimálního cíle.
Chcete-li zabránit cílovým mutacím,je nutné zlepšit metody pro editaci genomu, zvýšit jejich přesnost. V budoucnu bude tedy možné snížit riziko mutací na úroveň pozadí a poté se uklidnit tím, že k mutacím dochází přirozeně. Jak říkají, není třeba být svůdnější než papež.
- To znamená, že když tyto dívky vyrostou, bude nerealistické přesně pochopit, jaké mutace měli v důsledku akcí Jiankui?
- Mluvíme-li konkrétně o CCR5, pak samozřejmě,je to možné. A pro celý genom - v zásadě je to nyní možné, pokud vezmete genetický materiál jejich otce a matky a porovnáte je s jejich vlastním. Pak bude jasné, jaké rodiče mají možnosti a které z těch, které jsou přítomny v dívčím genomu, ani máma, ani táta. Další věcí je, že nebude možné zjistit, které mutace vznikly v důsledku CRISPR / Cas a které náhodně. Můžete porovnat pouze četnost těchto mutací: kolik normálních mutací se vyskytuje při narození a kolik z nich má tyto dívky. Pokud bude větší řád, bude vše jasné.
Technologie editace genomu CRISPR/Cas9 má potenciál eliminovat tisíce dědičných onemocnění, která byla dříve považována za nevyléčitelná.
Hlavní rozdíl mezi genovým nástrojemeditace CRISPR / Cas9 z jiných, dostatečně dlouhých existujících metod - to je možnost směrových změn DNA. CRISPR / Cas9 umožňuje specificky ovlivnit sekvenci DNA a dokonce změnit zlomený gen na správný. Za tímto účelem speciální enzym, nukleasa, zavádí mezeru na správném místě v genomu, po které se zapne opravný systém - vnitřní mechanismy buňky k obnovení genomu. V tomto případě je DNA opravena zpravidla v místě přerušení náhodnými chybami, což s největší pravděpodobností povede ke ztrátě nebo vložení několika písmen v sekvenci a výskytu mutací. Proto hledá jako vzorek požadované sekvence v sousedních genomech. Podle technologie musí buňka najít tuto sekvenci ve speciálních fragmentech DNA. Jejich genetika se do buňky zavedla, aby ji vzala a samostatně ji zavedla do sebe. Náhodné mutace v místě ruptury se však vyskytují mnohem častěji než řízená reparace podél vzorku.
Další otázka, Konstantin Severinov (ruský specialista v oblasti molekulární biologie a CRISPR/Cas – Hitech) jednou vyjádřil zajímavou myšlenku, že pokud by tam bylo něco naprosto hrozného, dívky by ve fázi embryogeneze prostě nepřežily.S největší pravděpodobností nebylo ovlivněno nic zásadního na jejich genomu.Jediné, co mě děsí, je onkologie.podobné nemoci.
- Proč? Stává se onkologie pravděpodobnější v důsledku úpravy lidského genomu?
Pojďme se podívat na příčiny rakoviny.Existují tři z nich: dědičné mutace, to znamená, že speciální alely, které nesoupravděpodobnost zvýšeného rizika rakoviny, jako je Angelina Jolie; virové příčiny – například lidský papilomavirus; a náhodné mutace.Obávám se výskytu mutací druhého typu u dívek v čínském experimentu, zejména pokud by došlo k vysoké frekvenci mutací.V tomto případě se pravděpodobnost výskytu jakéhokoli typu nádoru liší od nuly.
Dmitrij Madera. Foto: Science Bar Hopping
Jak upravit lidský genom, přední země a osud ruské genetiky
- Jak je snazší provádět takové experimenty se zvířaty?
— Upravit genom každého zvířetepotřebujete svůj vlastní protokol. Musíte upravit myš nebo krávu pomocí různých protokolů. A člověk, stejně jako jiné zvíře, vyžaduje jeho vývoj pro sebe, aby mohl co nejúčinněji upravit svůj genom. Nedá se tedy říci, že je těžší upravit člověka než krávu. Jen je potřeba to udělat jinak než s myší nebo potkanem. Ale přístupy zůstávají stejné. U nás se nic moc neliší.
- To jeproblém spočívá pouze v oblasti etiky a práva? A pokud by se rozhodlo, bylo by více experimentů?
- Nepochybně.A pak je tu vlastně docela hodně experimentů. Jezdím na konference a často se setkávám s kolegy. Například Oregonská univerzita provádí vynikající experimenty s úpravou lidského genomu a pěstováním embryí. Jednoduše jsou následně zničeny v určité, rané fázi. Takové experimenty nejsou zakázány. Ve skutečnosti je jediným omezením implantace embrya a jeho kultivace až do porodu.
- Které země jsou dnes lídrem ve výzkumu úpravy lidského genomu?
— Mezi nimi a všemi jsou nyní dva takoví vůdcizbytek je absolutní propast. Jedná se o USA a Čínu. Nikdo není ještě blíž, jsou ve svém výzkumu tak vzdáleni zbytku světa.
- Souvisí to s financováním nebo vědeckou základnou?
- S oběma.Čína investuje spoustu peněz do výzkumu, jejich vládu to velmi znepokojuje. A pokud dříve jednoduše kopírovali technologii, nyní čínští vědci dělají zajímavé věci. A v USA je prostě velmi silná vědecká základna. Kde byly vlastně všechny ty CRISPR/Cas objeveny Většina objevitelů této metody, kromě Jennifer Doudnové, jsou Číňané, ale pracují v USA. Mezi oběma zeměmi tedy existovala taková synergie.
— Co brání Rusku v rozvoji v této oblasti? Dokonce i prezidentprohlásilo prioritě výzkumu ve směru genetiky.
- Řeknu to, dnes již existuje financovánívýzkum - je přiděleno hodně peněz. Ale to vše se samozřejmě neděje za jednu hodinu. Potřebujeme vědeckou základnu a školu. V Rusku je z hlediska genetiky po lysenkoismu všechno smutné. Před Lysenkem byla sovětská škola genetiky jednou z nejlepších na světě. Vavilov odešel do Morganu (Thomas Morgan - jeden ze zakladatelů genetiky, nositel Nobelovy ceny - „High Tech“) a komunikovali za stejných podmínek. Po Lysenko bylo všechno barbarsky zničeno. A od té doby se nemůžeme vzpamatovat. Ano, peníze jsou velmi důležité. Je však také nutné, aby děti chodily studovat, aby byly zapojeny zahraniční odborníci. A pokud bude škola, bude v Rusku genomická editace.
- Jak to ovlivní nedávná doporučení týkající se komunikace mezi ruskými a zahraničními vědci - ohlásit všechny kontakty, prakticky komunikovat, jako v Sovětském svazu?
- To je velmi děsivé. Nejhorší věc, kterou lze pro ruskou vědu udělat a úplně ji zabít, jsou tato doporučení. A chápu, že se jedná pouze o doporučení a nemusí se dodržovat. Ale lidé, jak víte, se bojí. A začnou je aktivně provádět. Zejména ne vědci, ale byrokraté z vědy. Začnou přestat komunikovat se zahraničními vědci. Znám příběh, když kolegové z Německa jednou přišli na nějakou konferenci v Rusku a zahraniční vědci k nám často nepřicházejí a kvůli těmto požadavkům nebyli do akce povoleni. Věda je mezinárodní a musíte komunikovat a spolupracovat s kolegy co nejvíce, a pak to bude dobré. Tyto požadavky důrazně odsuzuji.
Léčba hluchoty, nebezpečných nemocí a dodávky léků
— Ruský genetik Denis Rebrikovjít doeditovat genom embryí pro páry se sluchovým postižením. Jaká je pravděpodobnost úspěchu takového experimentu?
— Denis Vladimirovič vzal v úvahu všechny své chybyČínský kolega. Bude dělat sekvenování celého genomu. A samotný experiment bude probíhat ve více kontrolovaném prostředí, nikoli v polopodzemních podmínkách, jako tomu bylo v případě Jiankui. Myslím si, že úspěch je v zásadě z metodologického hlediska možný a ukazuje se, že všechno není tak děsivé, zvláště při použití moderních metod. A úroveň mutace může být na úrovni pozadí. Co se týče těchto nemocných dětí, ano, jedná se o monogenní mutaci a je dominantní, čili je celkem snadné ji zničit, což se genetikům již daří. A ve skutečnosti je to tak, nic už nestojí v cestě.
— Jak to zapadá do ruské legislativy?
- Pokud jde o legislativní aspekty, Rebrikovna tom to prostě funguje. A v tomto smyslu je velmi zajímavé vědět, co se tam děje. Opravdu bych chtěl, aby se mu podařilo prorazit tuto legislativní zeď. Přestože jeho příklad a nemoc, kterou si vybral, podle názoru mnoha mých kolegů a mých nejsou tak relevantní. Ale pole se otevírá obrovské, takže ať je to první a vykazuje dobrý výsledek. A dále bude možné rozšířit „repertoár“.
- Jaká další nebezpečná onemocnění lze léčit přípravkem CRISPR / Cas?
— Samozřejmě, cystická fibróza je velmi závažnáchoroba. Editaci genů je možné využít v léčbě Duchennovy svalové dystrofie, alespoň u některých pacientů, kteří mají mutaci k tomu více či méně vhodnou. Monogenních genetických onemocnění je obecně více než 10 000. A zde je otázka, která metoda je pro léčbu pohodlnější a jednodušší. Například spinální svalová atrofie by se neměla léčit editací, ale jednoduše terapií náhrady genů.
Cystická fibróza- systémové dědičné onemocnění,způsobené mutací v genu pro transmembránový regulátor cystické fibrózy a charakterizované poškozením exokrinních žláz a těžkou dysfunkcí dýchacích orgánů. Cystická fibróza je zvláště zajímavá nejen pro její rozšířenou prevalenci, ale také proto, že byla jednou z prvních dědičných chorob, která byla léčena. Cystická fibróza byla poprvé uznána jako samostatná entita Dorothy Andersenovou v roce 1938.
Duchenneova myodystrofie- způsobené vymazáním nebo duplikací jednohonebo několik exonů nebo bodových mutací v genu pro dystrofin. Hlavním projevem je svalová slabost, pohybové potíže od dětství, které postupem času progredují. Smrt obvykle nastává ve druhé nebo třetí dekádě života. Jeho průměrná doba trvání je 25 let, ale jsou lidé, kteří žijí déle.
- Kdy to budou vědci schopni udělat? Jaký je časový rozsah?
- Podívejte, zvířata už jsou ošetřena.Pravda, nejprve samozřejmě „mrzačí“ (to znamená, že vyrábějí modelová zvířata pro studium nemocí), a pak léčí. Ale to vše přichází pouze na vědomou kliniku a zpravidla to trvá 5 až 15 let. A pokud tomu dobře rozumím, vzhledem k tomu, že jde o zcela nový přístup, budou první klinické studie trvat velmi dlouho. To znamená, že si budeme muset počkat 15–20 let. Pak to bude vypadat takto: přijďte, nechte se okamžitě diagnostikovat a léčit.
Dmitrij Madera. Fotografie: Science Bar Hopping
- To znamená, že nejde o úpravu genomu embryí, ale o ošetření dospělých?
— Oba přístupy budou možné.
- Promluvme si ogenová editacebez dvojitého rozbití. Proč to vědci nedokázali dříve?
"Věc je, že to není vůbec jednoduché."Když jsem poprvé četl publikaci Nature, pomyslel jsem si: "Ach, jak to, že mě to nenapadlo?" Vtipy stranou, bylo to hodně práce, protože zpočátku existoval podobný nápad, ale když to vědci zkusili, neuspěli. Pak začali měnit reverzní transkriptázu, v podstatě ji mutovali, aby fungovala jinak. A už při určité iteraci to začalo fungovat a začalo něco takového vyrábět. Byl to proces, který vyžadoval spoustu času a financí. Proto se nedivím, že mezi vynálezem jednoduše CRISPR/Cas a nástupem metody využívající reverzní transkriptázu uplynula doba. Protože je to netriviální.
- Jaké příležitosti se díky této nové metodě otevírají?
- Příležitosti jsou skvělé, protože nyníUkazuje se, že s minimálním rizikem výskytu cílových mutací můžeme velmi specificky změnit jakýkoli gen, alelu. Pokud například chceme vytvořit bodovou mutaci, vytvořte odstranění nebo komplexní náhradu. To nám dává skvělé příležitosti, protože z velké části je obvykle jedna nebo dvě mutace nebo delece, které se vyskytují, malé a mohou být obnoveny v rozmezí 40–50 nukleotidů.
Ve skutečnosti existovaly technologie o něco dříve -nukleotidové editory, které jednoduše odebraly a nahrazovaly například „A“ za „G“ nebo „C“ za „T“. Taková díla byla a jsou stále používána, ale samozřejmě tam není vše jednoduché, protože se ukáže, že editují nejen DNA, ale také RNA, a netvrdí, že je to velmi velké - nejedná se přesně o úpravy jeden nukleotid a celé „okno“. Možná se to také následně vyvine v praktické použití. Ale zatím existuje mnoho problémů. Tuto metodu jsem si pamatoval, protože také nezahrnuje dvojvláknové přestávky. A vzniklo o něco dříve než tyto nedávné studie.
— Inženýři z MIT a Harvardských univerzitpoužitéCRISPR k vytvoření systému podávání léků, který je uvolňuje pouze v konkrétním okamžiku. Jak přesně se to děje?
- Když mluvíme konkrétně o této metodě, pak o nípodstata spočívá v tom, že DNA je polymer a Cas12a ho rozřeže, čímž se zničí polymerní struktura. Pokud je DNA začleněna do hydrogelu, pak se z ní uvolní látky, které byly předtím v hydrogelu fixovány pomocí řetězců DNA. To znamená, že zde DNA funguje jednoduše jako fyzický materiál, který může být kontrolovaným způsobem rozložen. Obecně se hydrogely používají na rány a jiná zranění, pokud je z nich nutné postupně uvolňovat léky.
V zásadě by CRISPR/Cas mohl něco přinéstnezbytné pro pozici v genomu. To je vše, co umí. Ale nemůže dopravit lék do buňky. Není tedy zcela správné hovořit o jeho použití pro podávání léků.
Ale dodat CRISPR / Cas asléky do buňky, jsou nutné způsoby podávání. A existují - mohou být virové i nevirové. Viry se samozřejmě během své historie vyvinuly, aby do buňky dodaly určitý genetický materiál. Rozmnožují se tak. A nevírusové metody jsou jednoduše chemické metody, když jsou vytvořeny některé nosiče, které uvnitř obsahují molekuly nukleových kyselin, ne nutně DNA, mimochodem to může být dokonce RNA nebo protein. Obvykle se jedná o kapičky tuku, které chrání to, co musí dodávat před nukleázami a proteázami, a mohou se na ně také zavěsit protilátky, aby jim poskytly specifičnost pro konkrétní buňku. A tyto lipofilní komplexy dodávají léky do buňky. A existují práce související s komplexními polymery nebo zlatými nanočásticemi, které, jako dělo, spálené buňky, do nich létají a dodávají svůj obsah, jako je například genomické dělo.
- Je možné díky genové editaci výrazně prodloužit život člověka? Kolik toho lze udělat a jaké nemoci je třeba tímto způsobem léčit?
- Složitý problém.Faktem je, že existují mutace, které u zvířat způsobují určité prodloužení života, zpomalení stárnutí. Obvykle jsou spojeny se systémem opravy DNA. Stárnutí je v mnoha ohledech důsledkem hromadění náhodných chyb, které vedou k aktivaci retrovirových elementů a v důsledku toho není genom regulován a začíná působit proti svému hostiteli. Je tu jeden bod, nevíme, jak to bude fungovat u lidí. Bohužel, a to bylo velkým překvapením, mechanismy stárnutí a ochrany proti němu jsou druhově velmi specifické. A pro lidi se tytéž myši ukazují jako ne zcela adekvátní model. A čím je model adekvátnější a čím déle žije, tím obtížnější je s ním pracovat. Například stejný SIRT6 - u dlouhověkých druhů je to jedna a u krátkověkých je to jiné, existuje jasná korelace. Zdálo se, že vezměte a vložte SIRT6 ze slona do člověka. Nebo několik kopií lidského SIRT6 (gen kódující protein sirtuin-6 pomáhá opravit poškození DNA - dvouvláknové zlomy a substituce v písmenech genetických nukleotidů - Hi-Tech). To může fungovat, nebo nemusí. Taková možnost tu je a já bych to samozřejmě zkusil. Ale pokud mluvíme o prodloužení života, pak s největší pravděpodobností potřebujeme upravit geny spojené s opravou DNA. Dnes je to však pro takový organismus, jako je člověk, pouze hypotéza.