Využití genetického inženýrství ve vědeckém výzkumu
- Genový knockout
Studovat funkci jednoho nebo druhého
Pro knockout je stejný gen nebo jeho fragment syntetizován, modifikován tak, že genový produkt ztrácí svou funkci. Hlavní implementační metody: zinkový prst, morfolino a TALEN.
Pro získání knockoutovaných myší byly získányGeneticky konstruovaný konstrukt je zaveden do embryonálních kmenových buněk, kde konstrukt prochází somatickou rekombinací a nahrazuje normální gen, a změněné buňky jsou implantovány do blastocysty náhradní matky. U ovocné mušky jsou u velké populace iniciovány mutace Drosophila, ve kterých se potom hledají potomci s požadovanou mutací. Rostliny a mikroorganismy jsou vyřazeny podobným způsobem.
- Umělý výraz
Logickým doplněním knockoutu jeumělý výraz, tj. přidání genu do těla, který předtím neměl. Tuto techniku genetického inženýrství lze také použít ke studiu funkce genů. V podstatě je proces zavádění dalších genů stejný jako u knockoutu, ale stávající geny nejsou nahrazeny nebo poškozeny.
- Vizualizace genového produktu
Používá se, když je úkolem studovatlokalizace genového produktu. Jednou z metod označování je nahrazení normálního genu jedním fúzovaným s reportérovým prvkem, například s genem zeleného fluorescenčního proteinu GFP. Tento protein, který fluoreskuje v modrém světle, se používá k vizualizaci produktu genetické modifikace.
I když je tato technika pohodlná a užitečná, má vedlejší účinkydůsledkem může být částečná nebo úplná ztráta funkce studovaného proteinu. Sofistikovanější, i když ne tak pohodlnou metodou, je přidat ke studovanému proteinu ne tak velké oligopeptidy, které lze detekovat pomocí specifických protilátek.
- Vyšetřování expresního mechanismu
V takových experimentech je úkolem studovatpodmínky genové exprese. Rysy exprese závisí primárně na malém kousku DNA umístěném před kódující oblastí, nazývaném promotor, který slouží k navázání transkripčních faktorů.
Toto místo se zavádí do těla umístěním zamísto vlastního reportérového genu například GFP nebo enzym, který katalyzuje snadno detekovatelnou reakci. Kromě toho, že je zřejmé patrné fungování promotoru v určitých tkáních v té či oné době, umožňují takové experimenty studovat strukturu promotoru odstraněním nebo přidáním fragmentů DNA a také uměle zvýšit jeho funkce.
Proč je potřeba lidské genetické inženýrství?
Když se aplikuje na člověka, genetické inženýrství to dokážepoužívané k léčbě dědičných onemocnění. Technicky však existuje významný rozdíl mezi léčením samotného pacienta a úpravou genomu jeho potomka.
Úkolem změnit dospělý genomje poněkud složitější než šlechtění nových geneticky upravených plemen zvířat, protože v tomto případě je nutné změnit genom mnoha buněk již vytvořeného organismu, a ne pouze jednoho embryonálního vajíčka. K tomu se navrhuje použít virové částice jako vektor.
Virové částice jsou schopny proniknout dovnitřvýznamné procento dospělých lidských buněk, které do nich vkládají svou dědičnou informaci; je možná řízená reprodukce virových částic v těle. Aby se snížily vedlejší účinky, vědci se zároveň snaží vyhnout zavádění geneticky upravené DNA do buněk pohlavních orgánů, čímž se vyvarují dopadu na budoucí potomky pacienta.
Za zmínku stojí také významná kritika této technologie v médiích: vývoj geneticky upravených virů je mnohými vnímán jako hrozba pro celé lidstvo.
Pomocí genové terapie je možné v budoucnu změnit lidský genom. V současné době jsou účinné metody modifikace lidského genomu ve fázi vývoje a testování na primátech.
Dlouhé genetické inženýrství opicčelili vážným potížím, ale v roce 2009 byly experimenty korunovány úspěchem: v časopise Nature se objevila publikace o úspěšném použití geneticky upravených virových vektorů k vyléčení barvoslepoty u dospělého opičího samce. Ve stejném roce byla vydána první modifikovaný primát (vypěstovaný z upraveného vejce) přivedl na svět potomstvo - kosmana obecného (.Callithrix jacchus).
Ačkoli v malém měřítku, genetické inženýrství již anoslouží k tomu, aby ženy s určitými typy neplodnosti měly šanci otěhotnět. Slouží k tomu vajíčka od zdravé ženy. V důsledku toho dítě zdědí genotyp od jednoho otce a dvou matek.
Možnost zavedení je však významnějšízměny v lidském genomu čelí řadě vážných etických problémů. V roce 2016 získala skupina vědců ve Spojených státech souhlas s klinickými zkouškami metody léčby rakoviny s využitím vlastních imunitních buněk pacienta, které jsou geneticky modifikovány pomocí technologie CRISPR / Cas9.
Na konci roku 2018 se v Číně narodily dvě děti,jejichž genom byl uměle změněn (gen CCR5 byl vypnut) v embryonálním stadiu pomocí metody CRISPR/Cas9, v rámci výzkumu prováděného od roku 2016 v boji proti HIV. Jeden z rodičů (otec) byl HIV pozitivní a děti se podle prohlášení narodily zdravé.
Protože experiment byl neautorizovaný (předProto byly všechny takové experimenty na lidských embryích povoleny pouze v raných fázích vývoje s následnou destrukcí experimentálního materiálu, tedy bez implantace embrya do dělohy a porodu dětí), vědec, který za to odpovídá neposkytují důkazy pro jeho prohlášení, která zazněla na mezinárodní konferenci o editaci genomu.
Na konci ledna 2019 čínské úřady oficiálně potvrdily fakta tohoto experimentu. Mezitím byl vědec zakázán zapojit se do vědecké činnosti a byl zatčen.
Jak se upravuje lidský genom?
- Metoda zinkových prstů
V kompozici se také nacházejí „zinkové prsty“lidské proteiny. Díky této metodě je možné navrhnout řetězec ZFN tak, aby rozpoznával konkrétní část DNA. To umožňuje cílit na konkrétní oblasti v komplexních genomech.
Domény zinkových prstů se nacházejí vlidské transkripční faktory - proteiny, které regulují proces syntézy RNA s templátem DNA. Při vytváření umělých nukleáz je možné sestrojit řetězec „zinkových prstů“ tak, aby rozpoznával konkrétní úsek DNA.
Pokud je takový řetěz dostatečně dlouhý, je to takmůže rozpoznávat relativně rozšířené sekvence DNA skládající se z řady trinukleotidových fragmentů. To znamená skutečnou možnost cíleného dopadu na konkrétní oblasti v rámci velkých komplexních genomů.
Odhalila však také metoda „zinkového prstu“.vážné nevýhody: za prvé se jedná o nepříliš striktní rozpoznávání trinukleotidových repetic, což vede k výraznému počtu štěpení DNA v „necílových“ oblastech.
Zadruhé se metoda ukázala jako velmi pracná adrahé, protože pro každou sekvenci DNA je nutné vytvořit vlastní optimalizovanou proteinovou strukturu nukleáz se zinkovým prstem. Proto není systém „zinkových prstů“ rozšířený.
- TALEN
V roce 2011 systém pojmenoval časopis Nature Methods„Metoda roku“ TALEN (transkripční aktivátorové efektorové nukleázy) díky široké škále možných aplikací v různých oblastech základní a aplikované vědy.
TALEN je jednou z metod cílené aplikacezlom v DNA s následným „hojením“ - k vypnutí genů u myší. Bezprostředně po nich byla tato technologie použita k zavedení mutace do myšího genomu, což vedlo k rozvoji jednoho z dědičných syndromů. Autoři metody modelování geneticky podmíněných chorob dokázali genom myši nejen „zkazit“, ale také jej opravit.
- CRISPR / Cas9
Metoda poskytuje přesný účinek na určené oblasti DNA a lze ji použít téměř v jakékoli moderní molekulárně biologické laboratoři.
Tento systém je založen na zvláštních oblastechbakteriální DNA - CRISPR (klastrované pravidelně se střídající krátké palindromické opakování nebo krátké palindromické klastrové opakování). Tyto repetice jsou odděleny mezerami - krátkými fragmenty cizí DNA. Ty jsou začleněny do genomu poté, co se DNA rekombinuje s jeho genomem.
Příklady úprav člověka
- Úpravy genomu přímo v těle
Nemoc 44letého obyvatele Arizony BrianaMado se projevil v raném dětství. Je nevyléčitelná a zdědí ji hlavně muži. Mukopolysacharidóza typu II je metabolická porucha: lidé s ní mají mutaci v genu odpovědném za produkci enzymu, který se podílí na rozkladu komplexních sacharidů. Ve výsledku se hromadí v buňkách a způsobují četné orgánové patologie.
Muž se rozhodl zúčastnit se klinického vyšetřenítestování nové metody – genové terapie. Toto je pouze první fáze studie a před registrací terapie (tedy před povolením použití této metody pro všechny pacienty s Hunterovým syndromem) musí být tři.
Metoda použitá v Brianově případěMado umožňuje upravovat genom přímo v lidském těle – a zároveň přesně cílit na konkrétní úsek DNA. K úpravám dochází pomocí takzvaných „zinkových prstů“.
- Geneticky modifikované děti
Čínský výzkumník He Jiankui před oplodněním in vitro upravil genomy lidských embryí, což mělo za následek dvě děti se změněnou DNA.
Výzkumník systému CRISPR / Cas9během reprodukční léčby upravil genomy sedmi párů embryí. V důsledku jednoho z těhotenství se ze zdravé matky a otce infikovaného HIV narodila dvě dvojčata se změněnou DNA. Jiankui vysvětlil, že odstranil gen CCR5 z dětí, což jim poskytlo celoživotní imunitu proti HIV.
- Zpětná vize s genovou terapií
K obnovení vidění lze použít optogenetické technologie, pomocí nichž lze řídit práci neuronů pomocí světlocitlivých proteinů bakterií a laserových záblesků.
Na základě této myšlenky vytvořili biologové virus,které mohou proniknout do gangliových neuronů. Tyto nervové buňky jsou odpovědné za přenos signálů ze sítnice do lidského mozku. Virus, který se dostane do gangliové neurózy, způsobuje, že produkuje podobné signální molekuly. Tento postup však sám o sobě neobnovuje vidění, protože proteiny bakterií reagují na světlo odlišně od tyčinek a čípků sítnice.
Aby tento problém vyřešil, bazilejský profesorUniverzita Botond Rosca University a profesor Pittsburghské univerzity José Sahel vytvořili speciální brýle, které transformují příchozí obraz do formátu srozumitelného mozku a stimulují gangliové buňky laserovými záblesky. Ve výsledku může pacient vidět siluety velkých předmětů a objektů a provádět další složité akce.
Přečtěte si více:
Vědci testovali teorii panspermie na tardigradech: mohou cestovat ve vesmíru
Vědci zjistili, že super obohacené zlato se vytváří jako jogurt
Drobný vodíkový motor nahrazuje protějšky na fosilní paliva