Laboratoř hmotnostní spektrometrie Skoltechu vede člen korespondent Ruské akademie věd
Co leží v srdci budování životních procesů
DNA je dlouhý polymerní řetězec, který uchovává informace o tom, jak by tělo mělo vypadat a fungovat.Tedy jak se lišíme od ostatních druhůa jak se od sebe liší dva jedinci stejného druhu. Tyto molekuly určují naši jedinečnost. Uvedu příklad: housenka a motýl, do kterého roste. Myslíte si, že jejich molekuly DNA jsou různé nebo stejné? Ve skutečnosti je správná odpověď: totéž. Genetická informace se během života nijak nemění. Proč se vlastně housenky a motýli nakonec liší? Protože ne všechny informace uložené v DNA se realizují současně. K implementaci dochází procesem transkripce, v důsledku čehož po přečtení jednotlivých genů messenger RNA umožňuje syntézu proteinů.
Proteiny jsou univerzální molekulární stroje v našem těle, které plní různé funkce: od konstrukce po regulaci.Jedna ze zastaralých definic života jeuspořádaná existence a interakce proteinových molekul. Problém je ale v tom, že molekuly bílkovin jsou také velké. Proteiny jsou také polymerní molekuly s velkou molekulovou hmotností: obvykle od 10 do několika stovek kilodaltonů. A stavět na nich základní životní procesy je dost problematické, protože jsou dost citlivé na změny teplot a vnějšího prostředí. A to je pravděpodobně důvod, proč jsou téměř všechny životně důležité procesy v buňce realizovány prostřednictvím malých molekul. A přeměnu malých molekul na sebe už řídí bílkoviny. Molekulová hmotnost těchto malých molekul je od několika desítek do několika stovek kilodaltonů. Všechny malé molekuly, které se nacházejí v živém organismu, se nazývají metabolity.
1 dalton nebo 1 jednotka atomové hmotnosti (amu)- mimosystémová jednotka hmotnosti používaná pro hmotnosti molekul, atomů, atomových jader a elementárních částic.
1 a. jednotky = 1 660 539 066 60 (50) ⋅ 10−27 kg.
Primární metabolity jsou chemikálie, které se nacházejí ve všech buňkách těla a jsou nezbytné pro udržení životně důležitých procesů.Všechny molekuly polymerů, proteiny anukleové kyseliny. Tyto metabolity jsou stejné pro všechny buňky jednoho organismu. Během života se metabolity přeměňují na sebe, například za účelem přenosu energie. A tyto transformační cesty – transformační řetězce – se nazývají metabolické dráhy.
Krebsův cyklus nebo cyklus trikarboxylové kyseliny je zodpovědný za proces buněčného dýchání.
Různé metabolické dráhy v lidském těle se protínají, to znamená, že mají společné účastníky.Všechny procesy, které se vyskytují s metabolity, jsou tedy vzájemně propojeny.
Sekundární metabolity jsou látky, které nejsou nezbytné pro všechny buňky k zajištění jejich životních funkcí.Obvykle se používají k přizpůsobení se podmínkámvnější prostředí. Například kávovníky produkují kofein, aby chránily své listy před škůdci. Jsou toxické pro brouky, které jedí listy kávovníků. Pokud ale nějakým způsobem odstraníme všechen kofein z rostliny, bude žít dál. Žádné životně důležité procesy nebudou narušeny. Druhým příkladem jsou antibiotika. Víte, že penicilin je první antibiotikum a bylo zcela náhodně izolováno z plísní, což způsobilo revoluci v medicíně. Plísně používají penicilin k vyčištění svého životního prostoru. Je neškodný pro rodičovský organismus, ale toxický pro ostatní mikroorganismy. Ve skutečnosti lidé používají tuto vlastnost k léčbě různých bakteriálních infekcí. Vzhledem k tomu, že lidé aktivně konzumují rostliny jako potravu, je naše tělo hustě osídleno různými mikroorganismy, které tvoří mikroflóru. Tyto látky jsou sekundárními metabolity nejen člověka samotného, ale i živých organismů, které se nevyhnutelně dostávají do našeho těla.
Přirozený filtr a proč je špatně
Xenometabolity jsou antibiotika, sloučeniny, které nesouvisejí s aktivitou živých organismů.Obvykle je to něco, co člověk dostaluměle pro různé účely. Například léky, potravinářské přídatné látky, doplňky stravy, doping, drogy, zplodiny spalování tabáku, alkohol nebo hygienické výrobky, domácí chemikálie, ekotoxické látky. Jsou to také malé molekuly a do těla se dostávají jak záměrně, v případě léků, tak náhodně. Například jste si vyčistili zuby, spolkli zubní pastu – a tak se do vašeho systému dostaly nové chemikálie. A mnohé z těchto látek mohou mít určité účinky na naše tělo, a to i ve velmi malých koncentracích. Navíc tento účinek může být buď pozitivní nebo negativní, nebo se může lišit v závislosti na množství této látky.
Játra jsou první překážkou vstupu cizích chemikálií do systémového oběhu.Snaží se odfiltrovat molekuly, kterétělo bude poškozeno a odstraní je, čímž zabrání jejich dalšímu uvolňování krevním řečištěm do orgánů. Játra mají mnoho filtračních mechanismů, ale žádný z nich nefunguje stoprocentně: jinak by nedocházelo k otravám a vážným následkům užívání jakýchkoli toxinů nebo léků. Játra však využívají toho, že naše tělo je z velké části voda, to znamená, že se skládá z 80 procent vody. Játra se proto snaží molekuly roztřídit na hydrofilní, které se rozpouštějí ve vodě, a hydrofobní. Játra „věří“, že pokud je látka hydrofilní, může se dále uvolňovat do systémového oběhu, protože by neměla způsobit velké škody. A pokud je látka hydrofobní, tak je s ní potřeba něco udělat, aby se dále neuvolňovala nebo alespoň aby byla hydrofilnější.
Játra mají dva mechanismy – metabolické fáze.V první fázi se o to snaží játraspeciální proteiny a enzymy rodiny cytochromu P450 tyto látky oxidují. V důsledku oxidace se mění struktura molekuly a ta se může stát hydrofilnější. Játra pak mohou tyto metabolity uvolňovat do krevního oběhu nebo se je snažit odstranit ledvinami močí nebo střevy. Pokud to nefunguje, játra mohou na tyto oxidované molekuly „přišít“ hotové, zaručeně ve vodě rozpustné molekuly.
Metabolismus jater zvyšuje rozmanitost malých molekul, které mohou skončit v našem těle.Například ve fázi oxidace se z jedné molekuly teoreticky vytvoří více než 500 různých nových molekul; není možné předpovědět, které z nich vznikají a které nikoli.
Nekonečná abeceda: Proč je tak obtížné studovat metabolity
Nukleové kyseliny mohou být reprezentovány jako pětipísmenná abeceda, ze které je vytvořen velký textový řetězec.Ano, samozřejmě, pořadí písmen v tomtolinie může být poměrně chaotická, i když během života se DNA nemění, ale prostě se kopíruje. Máme tedy určitá omezení, co tento řetězec bude. V případě proteinů je situace poněkud složitější: v abecedě již bude 20 písmen, tedy 20 aminokyselin, z nichž se proteiny staví, ale děje se tak i mimovolně. Z pohledu výzkumníka jsou si tedy tyto objekty také velmi podobné. A v případě metabolitů je extrémně problematické vyčlenit jakoukoli abecedu: ve skutečnosti je to celá periodická tabulka. A mezi pravidly formace - pouze pravidlo valence. Kromě toho existuje vlastnost uhlíkové chemie, která umožňuje, aby se dva atomy uhlíku spojily a následně přidaly neomezený počet atomů uhlíku nebo jiných atomů z periodické tabulky, což dává vzniknout obrovské chemické diverzitě takových molekul.
Ke studiu tak malých molekul a jejich rozmanitosti jsou zapotřebí speciální metody.Existují jednoduché:například organoleptická analýza, se kterou se setkal každý, kdo si udělal obecný krevní nebo močový test a viděl, že ve směru je čára „vůně, barva“. Když je potřeba najít konkrétní molekulu v roztoku, přidá se kapka předem zvoleného činidla. Pokud byla v roztoku molekula, dojde ke zbarvení, pokud nebyla, objeví se pouze sraženina. Mezi jednoduché metody patří také optická spektroskopie, kdy lze pomocí mikroskopu vyvozovat závěry ze struktury sedimentu. Docela populární jsou nyní imunochemické metody: jedná se o stejný test ELISA na COVID-19.
Omikové studie jsou ty studie, které studují kompletní populaci.A metabolomika znamená analýzu velkéhodata, která představují úplnou sadu malých molekul v organismu, buňce nebo orgánu. Soubor těchto údajů se liší podle různých odhadů od několika tisíc, pokud vezmeme v úvahu pouze primární metabolity, až po několik desítek tisíc, pokud k nim přidáme sekundární metabolity známých rostlin, bakterií a hub. Ve skutečnosti až několik set milionů, pokud vezmeme v úvahu veškerou chemickou rozmanitost, která může vstoupit do lidského těla. K jejich studiu jsou zapotřebí speciální metody: spektroskopie nukleární magnetické rezonance (NMR) a hmotnostní spektrometrie.
V průběhu 80leté historie existence NMR vědci zapojení do této metody obdrželi pět Nobelových cen.Čtyři - pro NMR a pátý - promagnetická rezonance. Metoda mírně odlišná od NMR spektroskopie, ale v principu velmi podobná. Metoda NMR je založena na skutečnosti, že některé atomy v periodické tabulce mají nenulový magnetický moment. Jsou to malé magnety a mohou interagovat s vnějším magnetickým polem. Tato interakce se projevuje štěpením energetických hladin. Metoda NMR umožňuje rozlišovat mezi různými atomy a atomy stejného prvku, ale v různých prostředích. V poslední době NMR ztrácí na popularitě, především kvůli vysoké ceně.
Jak vyrobit nabité částice ze složité směsi a zjistit jejich složení
Hmotnostní spektrometrie je metoda oddělování nabitých částic interakcí s elektromagnetickým polem.Vezmeme-li nějakou složitou směs skládající se zrůzné nabité částice a téměř každá molekula s moderními metodami hmotnostní spektrometrie může být přeměněna na nabitou formu přidáním protonu nebo odstraněním protonu z této směsi a aplikací elektromagnetického pole na tuto směs, pak částice v tomto poli začnou pohybovat a budou mít buď rychlost, nebo trajektorii v závislosti na hmotnosti. Lehké částice dorazí k detektoru dříve než těžké. Po zpracování dat z detektoru se získá hmotnostní spektrum, ve kterém podél osy Y bude intenzita signálu, která je úměrná počtu iontů, a podél osy X - hmotnost v iontech, nebo spíše, poměr hmotnosti k náboji. Hmotnostní spektrometrie navíc umožňuje měřit hmotnost s velmi vysokou přesností. To znamená, že je možné jednoznačně stanovit elementární složení iontu, nabitých částic nebo molekul, ze kterých byl vytvořen. Matematicky se tomu říká řešení diofantické rovnice v celých číslech: ve skutečnosti se jedná o výběr koeficientů v blízkosti každého atomu: m(C), m(H), k(O), z(N). A pouze jedna kombinace celých čísel m, n, k, z může dát hmotnost naměřenou hmotnostním spektrometrem.
Metodu hmotnostní spektrometrie navrhl na začátku dvacátého století Thompson.Vědci sestavili první hmotnostní spektrometr na světě as jeho pomocí učinil velký objev: experimentálně potvrdil existenci izotopů. Na druhou stranu nebyl schopen podat správnou interpretaci svých výsledků. Udělal to za něj jeho student William Aston: v roce 1922 dostal za tento objev Nobelovu cenu. Ve 20. století se v důsledku řady světových válek vyvinula hmotnostní spektrometrie jako metoda pro armádu. Na počátku svého vývoje našel hlavní uplatnění v jaderném průmyslu. Protože hmotnostní spektrometrie může oddělovat látky podle hmotnosti a určit izotopy, lze ji použít k oddělení izotopů, jako je uran. Za hmotnostní spektrometrii byly uděleny další dvě Nobelovy ceny: v roce 1989 - Wolfgang Paul a Hans Dehmelt a poté v roce 2002 - John Fenn a Kaishi Tanaka nezávisle na sobě provedli skutečnou revoluci. Navrhli vlastní metodu, která umožňuje získat nabitou částici z velké molekuly polymeru: z proteinů nebo z nukleových kyselin, aniž by došlo k jejímu zničení. To dalo podnět ke studiu. Žádná laboratoř – biochemická nebo molekulárně biologická – nyní nemůže fungovat bez vlastního hmotnostního spektrometru nebo bez dobře vybaveného sdíleného centra v ústavu.
Po určení hmotnosti iontu můžeme určit pouze elementární složení, ale ne strukturu molekul.Protože jedné elementární skladbě různých struktur může odpovídat obrovské množství. To znamená, že atomy v molekule mohou být uspořádány různými způsoby. Tomu se říká fenomén izomerie.
Hmotnostní spektrometři vymysleli způsob, jak získat trochu více informací o struktuře molekuly: v cestě létajícím zrychleným molekulám je postavena určitá překážka.Obvykle se jedná o molekuly plynu.Když se molekuly srazí s těmito molekulami plynu, mohou se oddělit od srážky. A pak hmotnostní spektrometr změří hmotnost nikoli původní molekuly, ale kousků, na které se rozpadla. A k tomuto rozpadu nedochází náhodně, ale podél nejslabších vazeb v molekule. Výsledné fragmenty jsou identické a jsou to molekulární otisky: jedinečné pro každou molekulu.
Chromatografie je metoda separace látek na základě jejich interakce se sorbenty.Sorbenty jsou něco, co může absorbovatdalší chemikálie a nejjednodušší je aktivní uhlí, které bereme při otravě. Na začátku 20. století ruský vědec Michail Tsvet prokázal, že pokud takové přírodní barvivo projde sloupcem naplněným křídou, pak místo jedné velké zelené skvrny získáte několik vícebarevných skvrn: od žluté po zelená. Nejprve si tedy uvědomil, že zelené barvivo z listů je směsí různých látek. A za druhé objevil chromatografii, za kterou v roce 1952 dostali Nobelovu cenu další vědci, kteří jeho metodu dovedli do nějaké moderní podoby. V moderní chromatografii se směs vede přes kolonu pomocí kapaliny nebo plynu, v závislosti na typu chromatografie. Kapalina „táhne“ molekuly dopředu, směrem k výstupu z kolony, a sorbent interferuje s každou molekulou různými způsoby. Ty nakonec opouštějí kolonu v různých časech, což lze zaznamenat a použít jako další otisk prstu pro identifikaci.
Od vyšetření mozkomíšního moku po metodu suché krve
Hmotnostní spektrometrie je v současné době jedinou metodou ke studiu mozkomíšního moku.V některých obtížných případech pro diagnostikuonemocnění je nutná punkce, propíchnutí páteře a odebrání vzorku mozkomíšního moku. Problém je ale v tom, že průměrně má člověk jen 120 ml mozkomíšního moku. A tato tekutina je pod tlakem, takže odběr i 1 ml tento tlak výrazně ovlivňuje a může vést k nevratným následkům pro tělo. Proto lze ve skutečnosti odebrat pouze několik mikrolitrů. Žádná ze stávajících metod, kromě hmotnostní spektrometrie, nedokáže zpracovat tak malá množství vzorků, protože čím menší vzorek, tím méně molekul má a tím citlivější musí být vaše zařízení. K tomu obvykle stačí citlivost hmotnostní spektrometrie. Po odběru je vzorek odstraněn z mechanických inkluzí a proteinů, aby se zabránilo poruchám zařízení. Po analýze je výsledek zpracován pomocí počítače a je získán „seznam funkcí“: výstup je přibližně 10–15 tisíc řádků. Sloupce vytvářejí vzorec, který definujeme s přesnou hmotností, intenzitou, která je úměrná množství této molekuly, a „otiskem prstu“.
Nejpřímější způsob použití tohotometabolomický experiment hmotnostní spektrometrie – porovnávání nemocných a zdravých lidí s cílem identifikovat, které molekuly se objevují, objevují a mění svou koncentraci, když nastane takový rozdíl.Obvykle existují dvě skupiny:zdraví lidé a lidé s pro nás zajímavým onemocněním, například se specifickou formou onkologie. Pro každý vzorek jsou získány takové desky a matematici je pak porovnávají a vizualizují, aby mezi nimi našli rozdíly.
První aplikace hmotnostní spektrometrie je v novorozeneckém screeningu.Každý novorozenec na základě nařízení Ministerstva zdravotnictví s2006, jsou povinni testovat na určitý soubor dědičných chorob. Nyní v každém případě v Moskvě testují nejméně 16 různých nemocí. Jsou takové nemoci a často se projeví hned v prvních minutách života, které, pokud se včas nezastaví, za týden nebo za pár dní mohou dítě zneschopnit na celý život. Proto musí být taková diagnostika provedena během prvních několika hodin života novorozence. Biomarkery téměř všech těchto onemocnění jsou metabolity s malými molekulami. To znamená, že nemoci se projevují ve formě poruch metabolismu, například akumulace určitých organických kyselin v krvi nebo určitých lipidů. A k této akumulaci přirozeně dochází ve velmi malých koncentracích, z nichž je třeba rozpoznat rozdíl ve změnách metabolismu. Kromě hmotnostní spektrometrie zde tedy žádná jiná metoda nebude fungovat.
Aby vyřešili problém s odběrem krve od dětí (ne tak velké množství krve a dětský strach z invazivních metod a lékařů), přišli s technologií na analýzu zaschlých krevních skvrn.Provede se malá punkce a jedna nebo vícedvě kapky krve přímo na malý kousek filtračního papíru. Objem krve je zde několik mikrolitrů. Poté se tato karta vysuší a odešle do laboratoře a odeslání je také velmi pohodlné: vzorek není třeba zmrazovat ani rozmrazovat. Stačí znovu rozpustit tuto kartu pro analýzu a během několika hodin je analýza připravena.
Další oblastí použití pro hmotnostní spektrometrii je personalizovaná medicína.Všechny naše látky jdou do jater a do jaternějak je metabolizuje. Navíc naše játra fungují u každého z nás jinak, a to nejen kvůli některým nemocem nebo zlozvykům. Například grapefruitová šťáva může výrazně ovlivnit váš metabolismus, inhibuje některé enzymy a v důsledku toho může být vaše koncentrace některých léků několikanásobně vyšší, než byste očekávali. Někteří lidé budou mít tuto koncentraci v krvi po užití léku, zatímco jiní budou mít dvojnásobnou koncentraci. Ukazuje se, že dávkování je třeba snížit na polovinu, aby nedošlo k zbytečnému poškození těla. Proto přechod na personalizovanou medicínu. Vezmete si pilulku, každou hodinu vám odeberou krev a oni se podívají na křivku: jak látka putuje vaším tělem v čase, jaká je její koncentrace v krvi. Poté může lékař upravit dávkování nebo vám dokonce lék vysadit a předepsat jiný. A v tomto případě se velmi aktivně používá také analýza suché krve.
Každý nový lék vstupující na trh nutně prochází fází metabolického výzkumu.Některé léky nemusí být příliš toxické,ale v důsledku rozpadu v játrech a některých chyb se tyto látky mohou změnit v ještě toxičtější. Nejjednodušším příkladem je paracetamol. Návod k paracetamolu říká, že by se neměl podávat malým dětem. Že malým dětem by se měl podávat pouze ibuprofen. A důvodem je akumulace této molekuly v játrech, která má v důsledku metabolismu toxický účinek. U dospělého člověka s dobře vyvinutými játry není tento toxický účinek příliš patrný, i když samozřejmě byste neměli polykat ani paracetamol ve sklenicích. Pro malé děti to ve skutečnosti může vést k nejrůznějším nepříjemným a dokonce nevratným důsledkům. Proto musí být každý nový lék studován na metabolismus.
Zobrazování je způsob vedeníhmotnostní spektrometrická analýza, kdy získáváme informace nejen o homogenním, ale i heterogenním vzorku a můžeme studovat jeho molekulární složení v prostoru.Existuje tak zajímavý příklad pro studiumdistribuce léčiva a jeho metabolitů v těle krysy. Pokus se provádí následovně: kryse se podá určitý lék, po několika hodinách se zvíře utratí a poté se zvíře jemně rozřízne po celém těle. A pak speciální technika hmotnostní spektrometrie umožňuje studovat molekulární složení každého bodu tohoto vzorku. Po počítačovém zpracování je možné vizualizovat, kde se které metabolity nahromadily. Je důležité studovat distribuci metabolitů, protože pokud užíváte lék na zápal plic, je důležité, aby skončil v plicích a ne v mozku. Hmotnostní spektrometrický skalpel je „nůž“, který pumpuje molekuly z místa řezu a pomocí počítačové technologie je pak možné určit, který chirurg tkáň řezá: nemocnou nebo zdravou tkáň. Tato metoda je nyní implementována ve Spojených státech a první skutečná operace s takovým nožem již byla provedena.
Otisky prstů pro každou molekulu
Problém je v tom, že jednomu elementárnímu složení může odpovídat několik stovek nebo dokonce tisíců chemických sloučenin.Proto je nutné identifikovat všechny řádkytabulky, a to je hlavní úkol moderní metabolomické analýzy, bohužel není plně vyřešen; Molekulární otisky jsou porovnávány s otisky nalezenými v databázích chemických molekul. Pokud se shodují, pak můžeme s jistou jistotou říci, že toto je správná molekula. Tyto databáze však obsahují velmi omezený počet látek. Kompletní databáze otisků prstů obsahuje asi 20–30 tisíc sloučenin, nepokrývá ani všechny primární a sekundární metabolity, které se vyskytují v lidském těle. Je tu další problém: k doplnění této databáze potřebujete čistou chemickou látku, která je obvykle drahá. To znamená, že jedna čistá chemikálie obvykle stojí několik desítek nebo stovek dolarů.
Jedním z přístupů k identifikaci je vytvoření nových otisků prstů.Například metoda se nyní aktivně vyvíjíiontová pohyblivost spektrometrie. Zatímco hmotnostní spektrometrie dělí ionty podle hmotnosti, mobilita iontů umožňuje jejich oddělení podle velikosti. To znamená, že pokud máte dva běžce - ne těžkého a lehkého, ale velkého a malého a postavíte jim do cesty nějakou překážku - například síť s buňkami, pak štíhlý sportovec rychle prolezte touto sítí a dostaňte se do cíle, ale tlustý bude Dokud se z této sítě nedostane, po nějaké době přiběhne.
Druhou metodou je pokusit se najít otisky prstů, jejichž identifikace nevyžaduje čisté standardy.V laboratoři navrhujeme využít tzv. izotopovou výměnu.
Pokud se například podíváme na takovou molekulu, pakuvidíme, že má atomy vodíku spojené s kyslíkem. Jsou tedy speciální. Mohou tuto molekulu opustit a vrátit se k ní. Pokud máme tuto molekulu rozpuštěnou ve vodě, pak může vodík opustit molekulu a vodík se může vrátit z vody. A pokud vezmeme nejen vodu, ale těžkou vodu, kde místo vodíku je deuterium, pak může vodík opustit molekulu a deuterium může zaujmout své místo. Je známo, že deuterium se od vodíku liší molekulovou hmotností na jednotku a hmotnostní spektrometr může takový posun vidět. Pouhým spočítáním počtu takových vodíků můžeme říci, zda se jedná o nezbytnou nebo zbytečnou molekulu, ať už jsme ji identifikovali správně nebo ne.
K identifikaci molekul lze použít umělou inteligenci.Na základě dostupných informací můžete doplnitdatabáze chybějících informací pomocí metod hlubokého učení. To znamená, že trénujeme model a ten předpovídá potřebné otisky prstů na základě struktury molekuly, které pak můžeme použít k porovnání s tím, co bylo získáno v experimentu.
Viz také:
Uran získal status nejpodivnější planety ve sluneční soustavě. Proč?
Lidé vydrží velmi nízké teploty i bez zdrojů tepla
Fyzici vytvořili analogii černé díry a potvrdili Hawkingovu teorii. Kam to vede?