Dmitry Madera - leder af afdelingen for molekylær genetik på BIOCAD, lektor ved SPUFU, Ph.D.
I 2002 uddannede han sig fra Fakultet for biologi ved Moskvas statsuniversitetmed hovedfag i genetik. Han disputerede for graden doktor i filosofi i biologi i programmet til studiet af funktion og genekspression på University of Massachusetts, hvorefter han arbejdede ved National Institutes of Health og studerede de molekylære aspekter af kræftudviklingen og måder at påvirke dem på. I 2015 ledede han molekylærgenetiklaboratoriet på BIOCAD og har siden været engageret i udviklingen af genterapiprodukter. Han er forfatter til et internationalt patent, der beskriver en ny nuclease i Cas9-familien og artikler inden for kræftudvikling.
Han Jiankui-eksperimentet, risikoen for onkologi hos fødte piger og målrettede mutationer
— Hvad synes du om eksperimentet udført af den kinesiske biofysiker He Jiankui, som redigerede genomet af to embryoner? Eksperterkravat fødte piger kan have mutationer. Hvordan undgår man dette?— Efter at have studeret den originale kilde (MIT-forskning —"High-tech") og kommentaren fra genetikeren Fjodor Urnov, indså jeg, at medierne fordrejer informationen lidt. Ja, piger er mere tilbøjelige til at have mutationer. Dette refererer til de mutationer, der ikke vides præcis, hvor de vil forekomme. Og nu er det svært at fastslå præcis, hvor tilfældige mutationer opstod som følge af påvirkningen af CRISPR/Cas9. For at gøre dette skal du lave en sammenligning med pigernes forældre.
Formelt set er dette det korrekte udsagn:Ofte målmutationer kan faktisk eksistere. Og der er ikke noget, du kan gøre ved det. Og moderne genredigeringsmetoder forhindrer ikke dette. Det er faktisk problemet, for det kan være farligt.
I slutningen af 2018, den kinesiske videnskabsmand He Jiankuimeddelte, at han var i stand til at skabe genetisk modificerede tvillingepiger med medfødt immunitet mod HIV. Han sagde, at han redigerede embryoner fra par, der gennemgik IVF, og et af de syv forsøg var vellykket. Eksperimentet udløste en ny bølge af diskussioner om etikken i at forstyrre den menneskelige genetiske kode.
Dog Fedor Urnov, redigeringsspecialistUniversity of Californiens genom bemærkede i et interview med MIT Technology Review: "Påstanden om, at det gengiver den gældende CCR5, er en åbenlys fejrepræsentation," og tilføjede, at den kun kan beskrives som "forsætlig forkert gengivelse."
En ny undersøgelse fra MIT viste, at forskere ikke gør detvar i stand til at gengive den gældende version af CCR5. Selvom teamet sigter mod det rigtige gen, kopierede forskerne ikke den ønskede variation af Delta 32, men skabte i stedet nye udgaver, hvis virkning ikke er klar - mens de kan forårsage mutationer.
Påstår, at He Jiankui ikke var i stand til at mutereCCR5-genet (det gen, der tillader HIV at inficere menneskeceller - Hi-Tech) er forkert. Det nåede faktisk sit mål, og CCR5 var faktisk muteret og virker ikke længere, hvilket betyder, at HIV ikke kan inficere celler. Ja, han var tilsyneladende ikke i stand til at reproducere en specifik naturlig allel fundet i menneskelige populationer, men ikke desto mindre er CCR5 "slået ud" og virker ikke, hvilket betyder, at Jiankui har opnået minimumsmålet.
For at forhindre off-target mutationer,det er nødvendigt at forbedre metoder til redigering af genomet for at øge deres nøjagtighed. I fremtiden vil det således være muligt at reducere risikoen for mutationer til baggrundeniveauet og derefter roe ned på det faktum, at mutationer forekommer naturligt. Som de siger, er det ikke nødvendigt at være mere hellig end paven.
- Det vil sige, når disse piger bliver voksne, vil det være urealistisk at forstå nøjagtigt, hvilke mutationer de havde som et resultat af Jiankuis handlinger?
- At tale specifikt om CCR5, så selvfølgelig,det er muligt. Og for hele genomet - i princippet er det muligt nu, hvis man tager deres far og mors genetiske materiale og sammenligner det med deres eget. Derefter bliver det klart, hvilke muligheder forældre har, og hvilke af dem, der er til stede i pigers genom, hverken mor eller far har. En anden ting er, at det vil være umuligt at finde ud af, hvilke mutationer der er opstået som et resultat af CRISPR / Cas, og hvilke tilfældigt. Du kan kun sammenligne hyppigheden af disse mutationer: hvor mange normale mutationer der forekommer ved fødslen og hvor mange af disse piger. Hvis der kommer en større rækkefølge mere, er alt klart.
CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi har potentialet til at udrydde tusindvis af arvelige sygdomme, som tidligere blev anset for uhelbredelige.
Den største forskel mellem et genværktøjredigering af CRISPR / Cas9 fra andre, længe nok eksisterende metoder - dette er muligheden for retningsbestemt DNA-ændringer. CRISPR / Cas9 giver dig mulighed for specifikt at påvirke DNA-sekvensen og endda ændre det ødelagte gen til det korrekte. For at gøre dette introducerer et specielt enzym, nuclease, et hul på det rigtige sted i genomet, hvorefter reparationssystemet er tændt - de interne mekanismer i cellen for at gendanne genomet. I dette tilfælde repareres DNA på brudstedet som regel med tilfældige fejl, hvilket mest sandsynligt vil føre til tab eller indsættelse af flere bogstaver i sekvensen og udseendet af mutationer. Derfor søger hun som en prøve efter den ønskede sekvens i nabov genomer. Ifølge teknologi skal cellen finde denne sekvens i specielle DNA-fragmenter. Deres genetik introduceres i cellen for at tage den og uafhængigt introducere den i sig selv. Tilfældige mutationer på brudstedet forekommer imidlertid meget oftere end rettet reparation langs prøven.
Et andet spørgsmål, Konstantin Severinov (russisken specialist inden for molekylærbiologi og CRISPR/Cas - Hi-Tech) udtrykte på et tidspunkt en interessant idé om, at hvis der var noget helt forfærdeligt der, ville pigerne simpelthen ikke have overlevet selv på embryogenesestadiet. Mest sandsynligt var intet grundlæggende ved deres genom påvirket. Det eneste, der skræmmer mig, er onkologi. Jeg håber virkelig, at de ikke får lignende sygdomme.
- Hvorfor? Blir onkologi mere sandsynligt som et resultat af redigering af det menneskelige genom?
- Sikkert. Lad os tage et kig på årsagerne til kræft.Der er tre af dem: arvelige mutationer, det vil sige særlige alleler, der har sandsynligheden for at øge risikoen for kræft, såsom Angelina Jolie; virale årsager - humant papillomavirus, for eksempel; og tilfældige mutationer. Det er netop forekomsten af mutationer af sidstnævnte type hos pigerne fra det kinesiske eksperiment, som jeg frygter, især hvis der var en høj frekvens af mutationer der. Så er sandsynligheden for forekomsten af tumorer af enhver type forskellig fra nul.
Dmitry Madera. Foto: Science Bar Hopping
Sådan redigeres det menneskelige genom, de førende lande og den russiske genetiks skæbne
- Hvor meget lettere er det at udføre sådanne eksperimenter med dyr?
— At redigere genomet for hvert dyrdu har brug for din egen protokol. Du skal redigere en mus eller en ko ved hjælp af forskellige protokoller. Og mennesket, som et andet dyr, kræver dets udvikling for sig selv for at redigere sit genom mest effektivt. Derfor kan det ikke siges, at det er sværere at redigere en person end en ko. Du skal bare gøre det anderledes end med en mus eller rotte. Men tilgangene forbliver de samme. Der er ikke noget meget anderledes ved os.
- Det erproblemet ligger kun inden for etik og love? Og hvis det blev besluttet, ville der være flere eksperimenter?
- Utvivlsomt.Og så er der faktisk ret mange eksperimenter. Jeg går til konferencer og møder ofte kollegaer. For eksempel udfører University of Oregon fremragende eksperimenter med at redigere det menneskelige genom og dyrke embryoner. De bliver simpelthen efterfølgende ødelagt på et vist, tidligt tidspunkt. Sådanne eksperimenter er ikke forbudt. Faktisk er den eneste begrænsning implantationen af et embryo og dets dyrkning indtil fødslen.
- Hvilke lande er førende inden for forskning i redigering af det menneskelige genom i dag?
- Der er to sådanne ledere nu, mellem dem og alleresten er en absolut afgrund. Det er USA og Kina. Ingen er endnu tættere på, de er så langt væk fra resten af verden i deres forskning.
- Er det forbundet med finansiering eller videnskabelig basis?
- Med begge dele.Kina investerer mange penge i forskning, deres regering er meget bekymret over dette. Og hvis de tidligere blot kopierede teknologi, nu gør kinesiske videnskabsmænd interessante ting. Og i USA er der simpelthen et meget stærkt videnskabeligt grundlag. Faktisk, hvor blev alle disse CRISPR/Cas opdaget? De fleste af opdagerne af denne metode, bortset fra Jennifer Doudna, er kinesere, men de arbejder i USA. Derfor var der en sådan synergi mellem de to lande.
— Hvad forhindrer Rusland i at udvikle sig på dette område? Selv præsidentenHan erklæredeom prioriteringen af forskning i retning af genetik.
- Jeg vil sige dette, i dag er der allerede finansieringforskning - der afsættes mange penge. Men alt dette gøres naturligvis ikke på en time. Vi har brug for en videnskabelig base og skole. I Rusland, hvad angår genetik, er alt ked af det efter Lysenkoism. Før Lysenko var den sovjetiske genetikskole en af de bedste i verden. Vavilov gik til Morgan (Thomas Morgan - en af grundlæggerne af genetik, nobelprisvinderen - “High Tech”), og de kommunikerede på lige vilkår. Efter Lysenko blev alt ødelagt på en barbarisk måde. Og siden da kan vi ikke komme os. Ja, penge er meget vigtige. Men det er også nødvendigt, at børnene går til studiet, så udenlandske specialister er involveret. Og hvis der er en skole, vil der være genomisk redigering i Rusland.
- Hvordan vil dette blive påvirket af nylige henstillinger vedrørende kommunikation mellem russiske og udenlandske forskere - at rapportere alle kontakter, praktisk talt for at kommunikere, som i Sovjetunionen?
- Dette er meget skræmmende. Det værste, der kan gøres for russisk videnskab og dræbe det fuldstændigt, er disse henstillinger. Og jeg forstår, at dette kun er henstillinger, og at de ikke skal følges. Men folk, du ved, er bange. Og de begynder at udføre dem proaktivt. Især ikke forskere, men bureaukrater fra videnskaben. De vil begynde at stoppe med at kommunikere med udenlandske forskere. Jeg kender historien, da videnskabelige ægtefæller fra Tyskland kom til en konference i Rusland i nogen tid, og udenlandske forskere kommer ikke ofte til os, og de fik ikke lov til at komme ind på begivenheden på grund af disse krav. Videnskab er international, og du er nødt til at kommunikere og interagere med kolleger så meget som muligt, og så vil det være godt. Jeg fordømmer kraftigt disse krav.
Behandling af døvhed, farlige sygdomme og medicinafgivelse
— Den russiske genetiker Denis Rebrikovgår tilredigere genomet af embryoner til par med hørenedsættelse. Hvor sandsynligt er succesen af et sådant eksperiment?
- Denis Vladimirovich tog højde for alle sine fejlkinesisk kollega. Han vil lave hele genomsekventering. Og selve eksperimentet vil foregå i et mere kontrolleret miljø, ikke i semi-underjordiske forhold, som det var tilfældet med Jiankui. Jeg tror, at succes i princippet fra et metodisk synspunkt er mulig, og det viser sig, at alt ikke er så skræmmende, især når man bruger moderne metoder. Og mutationsniveauet kan være på baggrundsniveau. Med hensyn til disse syge børn, ja, det er en monogen mutation, og den er dominerende, det vil sige, at det er ret nemt at ødelægge det, hvilket genetikere allerede gør godt. Og faktisk er det det, intet står længere i vejen.
— Hvordan passer dette sammen med russisk lovgivning?
- Hvad angår de lovgivningsmæssige aspekter, Rebrikovdet fungerer bare på dette. Og i denne forstand er det meget interessant at vide, hvad der sker der. Jeg vil virkelig gerne have, at han lykkes med at bryde igennem denne lovgivningsmur. Selvom hans eksempel og sygdommen, som han valgte, efter mange af mine kollegers og min mening, ikke er så relevante. Men feltet åbner enormt, så lad det være det første og vise et godt resultat. Og yderligere vil det være muligt at udvide "repertoire".
- Hvilke andre farlige sygdomme kan behandles med CRISPR / Cas?
- Selvfølgelig er cystisk fibrose en meget alvorligsygdom. Det er muligt at anvende genredigering i behandlingen af Duchennes muskeldystrofi, i hvert fald hos nogle patienter, som har en mutation, der er mere eller mindre egnet til dette. Generelt er der mere end 10 tusinde monogene genetiske sygdomme.Og her er spørgsmålet, hvilken metode der er mere bekvem og enklere til behandling. For eksempel bør spinal muskelatrofi ikke behandles med redigering, men blot med gensubstitutionsterapi.
Cystisk fibrose- systemisk arvelig sygdom,forårsaget af en mutation i genet for den transmembrane regulator af cystisk fibrose og karakteriseret ved beskadigelse af de eksokrine kirtler og alvorlig dysfunktion af åndedrætsorganerne. Cystisk fibrose er af særlig interesse, ikke kun på grund af dens udbredte udbredelse, men også fordi det var en af de første arvelige sygdomme, der blev behandlet. Cystisk fibrose blev først anerkendt som en særskilt enhed af Dorothy Andersen i 1938.
Duchenne myodystrofi- forårsaget af sletninger eller duplikationer af eneller flere exoner eller punktmutationer i dystrofingenet. Den vigtigste manifestation er muskelsvaghed, besvær med at bevæge sig fra barndommen, som skrider frem over tid. Døden indtræffer normalt i det andet eller tredje årti af livet. Dens gennemsnitlige varighed er 25 år, men der er mennesker, der lever længere.
- Hvornår vil forskere kunne gøre dette? Hvad er tidsintervallet?
- Se, dyrene bliver allerede behandlet.Sandt nok, først "lemlæster de", selvfølgelig (det vil sige, de laver modeldyr til at studere sygdomme), og så behandler de. Men alt dette kommer kun til en bevidst klinik, og det varer som regel fra 5 til 15 år. Og som jeg forstår det, da dette er en helt ny tilgang, vil de første kliniske studier tage meget lang tid. Det betyder, at vi skal vente 15-20 år. Så kommer det til at se sådan ud: kom, bliv diagnosticeret og behandlet med det samme.
Dmitry Madera. Foto: Science Bar Hopping
- Det vil sige, vi taler ikke om redigering af embryogamet, men om behandling af voksne?
— Begge tilgange vil være mulige.
- Lad os snakke omgenredigeringuden dobbelt brud. Hvorfor kunne forskerne ikke gøre det før?
"Sagen er, at det slet ikke er let."Da jeg første gang læste Nature-publikationen, tænkte jeg: "Åh, hvordan tænkte jeg ikke på det?" Bortset fra vittigheder var det meget arbejde, for i starten var der en lignende idé, men da videnskabsmænd prøvede det, lykkedes det ikke. Så begyndte de at ændre den omvendte transkriptase, og muterede den i det væsentlige for at få den til at fungere anderledes. Og allerede ved en vis iteration begyndte det at virke og begyndte at producere sådan noget. Det var en proces, der krævede meget tid og finansiering. Derfor er jeg ikke overrasket over, at der gik tid mellem opfindelsen af simpelthen CRISPR/Cas og fremkomsten af metoden, der bruger revers transkriptase. Fordi det er ikke-trivielt.
- Hvilke muligheder åbner sig takket være denne nye metode?
- Mulighederne er store, for nudet viser sig, at vi med minimale risici for forekomst af offsetmutationer meget specifikt kan ændre ethvert gen, allel. Hvis vi f.eks. Vil etablere en punktmutation, skal du oprette en sletning eller en kompleks erstatning. Dette giver os store muligheder, fordi stort set normalt en eller to mutationer eller sletninger, der opstår, er små, og de kan gendannes inden for 40-50 nukleotider.
Der var faktisk teknologier lidt tidligere -nukleotidredaktører, der simpelthen tog og erstattede for eksempel “A” med “G” eller “C” med “T”. Sådanne værker var, og de bruges stadig, men selvfølgelig er alt ikke enkelt der, fordi det viser sig, at de redigerer ikke kun DNA, men også RNA, og de siger ikke, at det er meget stort - de redigerer ikke nøjagtigt et nukleotid og hele "vinduet". Måske vil dette også senere udvikle sig til praktisk brug. Men indtil videre er der mange problemer. Jeg huskede denne metode, fordi den heller ikke involverer dobbeltstrengede pauser. Og det opstod lidt tidligere end disse nylige undersøgelser.
— Ingeniører fra MIT og Harvard UniversiteteranvendtCRISPR til at skabe et lægemiddelleveringssystem, der kun frigiver dem på et bestemt tidspunkt. Hvordan sker det præcist?
- At tale specifikt om denne metode, så detessensen er, at DNA er en polymer, og Cas12a skærer den, hvorved polymerstrukturen ødelægges. Hvis DNA inkorporeres i hydrogelen, frigøres stoffer, der tidligere var fikseret i hydrogelen med DNA-strenge, derfra. Det vil sige, her fungerer DNA simpelthen som fysisk materiale, der kan nedbrydes på en kontrolleret måde. Generelt bruges hydrogeler på sår og andre skader, når en gradvis frigivelse af medikamenter fra dem er nødvendig.
I princippet kunne CRISPR/Cas levere nogetnødvendig for en position i genomet. Det er alt, han kan. Men den kan ikke levere medicinen ind i cellen. Så det er ikke helt korrekt at tale om dets brug til medicinafgivelse.
Men at levere CRISPR / Cas asmedicin i cellen; leveringsmetoder er nødvendige. Og de findes - de kan være virale og ikke-virale. Viraer har naturligvis udviklet sig gennem deres historie for at levere visse genetiske materialer til cellen. De formerer sig så. Og ikke-virale metoder er simpelthen kemiske metoder, når nogle bærere oprettes indeholdende inde i sig nukleinsyremolekyler, ikke nødvendigvis DNA, forresten, det kan endda være RNA eller protein. Normalt er det nogle smådråber, der beskytter, hvad de skal levere fra nukleaser og proteaser, og antistoffer kan også hænges på dem for at give dem specificitet for en bestemt celle. Og disse lipofile komplekser leverer medikamenter til cellen. Og der er værker relateret til komplekse polymerer eller guld-nanopartikler, som ligesom en kanon, sviddeceller, de flyver ind i dem og leverer deres indhold, såsom en genomisk kanon.
- Er det muligt at forlænge en persons liv markant takket være genredigering? Hvor meget kan dette gøres, og hvilke sygdomme skal helbredes på denne måde?
- Kompleks problemstilling.Faktum er, at der er mutationer, der hos dyr forårsager en vis forlængelse af livet, en opbremsning i aldring. De er normalt forbundet med DNA-reparationssystemet. Aldring er på mange måder en konsekvens af akkumulering af tilfældige fejl, der fører til aktivering af retrovirale elementer, og som et resultat er genomet ikke reguleret og begynder at arbejde imod sin vært. Der er en pointe her, vi ved ikke, hvordan det vil fungere i mennesker. Desværre, og det kom som en stor overraskelse, er mekanismerne for aldring og beskyttelse mod det meget artsspecifikke. Og for mennesker viser de samme mus sig ikke at være en helt tilstrækkelig model. Og jo mere passende modellen er og jo længere den lever, jo sværere er det at arbejde med den. For eksempel den samme SIRT6 - hos langlivede arter er den en, og hos kortlivede arter er den anderledes, der er en klar sammenhæng. Det så ud til at tage og indsætte SIRT6 fra en elefant til en person. Eller flere kopier af human SIRT6 (genet, der koder for sirtuin-6-proteinet, hjælper med at korrigere DNA-skader - dobbeltstrengsbrud og substitutioner i genetiske nukleotidbogstaver - Hi-Tech). Dette kan virke, eller det kan ikke. Der er sådan en mulighed, og jeg ville selvfølgelig prøve. Men hvis vi taler om at forlænge livet, så skal vi højst sandsynligt redigere gener forbundet med DNA-reparation. I dag er dette dog kun en hypotese for en sådan organisme som person.