Skoltechs massespektrometrilaboratorium ledes af et tilsvarende medlem af det russiske videnskabsakademi
Hvad der ligger i hjertet af opbygningen af livsprocesser
DNA er en lang polymerkæde, der gemmer information om, hvordan kroppen skal se ud og fungere.Altså hvordan vi adskiller os fra andre arterog hvordan to individer af samme art adskiller sig fra hinanden. Disse molekyler bestemmer vores unikke karakter. Lad mig give dig et eksempel: en larve og sommerfuglen, som den vokser ind i. Tror du, at deres DNA-molekyler er forskellige eller ens? Faktisk er det rigtige svar: det samme. Genetisk information ændres ikke på nogen måde i løbet af livet. Faktisk, hvorfor er larver og sommerfugle forskellige i sidste ende? For ikke al information, der er lagret i DNA, realiseres på samme tid. Implementering sker gennem transkriptionsprocessen, som et resultat af hvilken messenger-RNA efter læsning af individuelle gener tillader syntesen af proteiner.
Proteiner er universelle molekylære maskiner i vores krop, der udfører forskellige funktioner: fra konstruktion til regulerende.En af de forældede definitioner af liv erordnet eksistens og interaktion af proteinmolekyler. Men problemet er, at proteinmolekyler også er store. Proteiner er også polymermolekyler med en stor molekylvægt: sædvanligvis fra 10 til flere hundrede kilodalton. Og at bygge grundlæggende livsprocesser på dem er ret problematisk, fordi de er ret følsomme over for ændringer i temperatur og det ydre miljø. Og det er sandsynligvis derfor, næsten alle vitale processer i en celle realiseres gennem små molekyler. Og omdannelsen af små molekyler til hinanden er allerede styret af proteiner. Molekylvægten af disse små molekyler er fra flere tiere til flere hundrede kilodaltons. Alle små molekyler, der findes i en levende organisme, kaldes metabolitter.
1 dalton eller 1 atommasseenhed (amu)- en masseenhed uden for systemet, der anvendes til masser af molekyler, atomer, atomkerner og elementarpartikler.
1 a. enheder = 1.660 539066 60 (50) ⋅10−27 kg.
Primære metabolitter er kemikalier, der findes i alle celler i kroppen og er nødvendige til vedligeholdelse af vitale processer.Alle polymermolekyler, proteiner ognukleinsyrer. Disse metabolitter er de samme for alle celler i en organisme. I løbet af livet omdannes metabolitter til hinanden, for eksempel med henblik på energioverførsel. Og disse transformationsveje - transformationskæder - kaldes metaboliske veje.
Krebs-cyklussen eller tricarboxylsyrecyklussen er ansvarlig for processen med cellulær respiration.
Forskellige metaboliske veje i menneskekroppen krydser hinanden, det vil sige de har fælles deltagere.Således er alle processer, der forekommer med metabolitter, forbundet med hinanden.
Sekundære metabolitter er stoffer, der ikke er nødvendige for alle celler for at sikre deres vitale funktioner.De bruges normalt til at tilpasse sig forholdeneydre miljø. For eksempel producerer kaffeplanter koffein for at beskytte deres blade mod skadedyr. De er giftige for biller, der spiser bladene fra kaffeplanter. Men hvis vi på en eller anden måde fjerner al koffeinen fra planten, vil den fortsætte med at leve. Ingen vitale processer vil blive forstyrret. Det andet eksempel er antibiotika. Du ved, at penicillin er det første antibiotikum, og det blev fuldstændigt ved et uheld isoleret fra skimmelsvampe, hvilket revolutionerede medicinen. Skimmelsvampe bruger penicillin til at rydde deres opholdsrum. Det er uskadeligt for moderorganismen, men giftigt for andre mikroorganismer. Faktisk bruger folk denne egenskab til at behandle forskellige bakterielle infektioner. På grund af det faktum, at mennesker aktivt indtager planter som mad, er vores krop tæt befolket med forskellige mikroorganismer, der danner mikroflora. Disse stoffer er sekundære metabolitter, ikke kun af personen selv, men også af levende organismer, der uundgåeligt kommer ind i vores krop.
Det naturlige filter, og hvorfor det er forkert
Xenometabolitter er antibiotika, forbindelser, der ikke er forbundet med levende organismer.Det er normalt noget, en person har modtagetkunstigt til forskellige formål. For eksempel medicin, fødevaretilsætningsstoffer, kosttilskud, doping, stoffer, tobaksforbrændingsprodukter, alkohol eller hygiejneprodukter, husholdningskemikalier, økotoksiske stoffer. Disse er også små molekyler, og de kommer ind i kroppen både med vilje, i tilfælde af stoffer, og ved et uheld. Du børstede fx tænder, slugte tandpasta – og sådan kom der nye kemikalier ind i dit system. Og mange af disse stoffer kan have visse effekter på vores krop, selv i meget små koncentrationer. Desuden kan denne effekt være enten positiv eller negativ eller variere afhængigt af mængden af dette stof.
Leveren er den første barriere for indtrængen af fremmede kemikalier i den systemiske cirkulation.Det forsøger at filtrere molekyler frakroppen vil blive skadet og fjerne dem, hvilket forhindrer dem i at blive frigivet videre gennem blodbanen ind i organerne. Leveren har mange filtreringsmekanismer, men ingen af dem virker 100%: ellers ville der ikke være nogen forgiftning og alvorlige konsekvenser af at tage toksiner eller stoffer. Leveren udnytter dog, at vores krop i høj grad er vand, det vil sige, at den består af 80 procent vand. Derfor forsøger leveren at sortere molekylerne i hydrofile, som opløses i vand, og hydrofobe. Leveren "tror", at hvis stoffet er hydrofilt, så kan det frigives yderligere i det systemiske kredsløb, da det ikke burde forårsage meget skade. Og hvis et stof er hydrofobt, så skal der gøres noget med det for at forhindre det i at blive frigivet yderligere eller i det mindste gøre det mere hydrofilt.
Leveren har to mekanismer - metaboliske faser.I den første fase forsøger leveren atsærlige proteiner og enzymer fra cytochrom P450-familien oxiderer disse stoffer. Som et resultat af oxidation ændres molekylets struktur, og det kan blive mere hydrofilt. Leveren kan derefter frigive disse metabolitter til blodbanen eller forsøge at fjerne dem gennem nyrerne gennem urinen eller gennem tarmene. Hvis dette ikke virker, kan leveren "sy" færdiglavede, garanteret vandopløselige molekyler på disse oxiderede molekyler.
Leverstofskiftet øger mangfoldigheden af små molekyler, der kan ende i vores kroppe.For eksempel, på oxidationsstadiet, dannes teoretisk mere end 500 forskellige nye andre molekyler ud fra et molekyle; det er ikke muligt at forudsige, hvilke af dem der dannes, og hvilke der ikke er.
Det uendelige alfabet: hvorfor det er så svært at studere metabolitter
Nukleinsyrer kan repræsenteres som et alfabet med fem bogstaver, hvorfra en stor tekststreng konstrueres.Ja, selvfølgelig, rækkefølgen af bogstaver i dettelinje kan være relativt kaotisk, selvom DNA'et i løbet af livet ikke ændrer sig, men blot kopieres. Så vi har visse begrænsninger på, hvad denne streng vil være. For proteiners vedkommende er situationen noget mere kompliceret: Der vil allerede være 20 bogstaver i alfabetet, det vil sige 20 aminosyrer, som proteiner er bygget af, men det sker også ufrivilligt. Derfor ligner disse objekter fra forskerens synspunkt også ret meget om hinanden. Og i tilfælde af metabolitter er det ekstremt problematisk at udskille ethvert alfabet: faktisk er dette hele det periodiske system. Og blandt dannelsesreglerne - kun valensreglen. Derudover er der et træk ved kulstofkemi, der tillader to kulstofatomer at binde sig til hinanden og så efterfølgende tilføje et ubegrænset antal kulstofatomer eller andre atomer fra det periodiske system, hvilket giver anledning til en enorm kemisk diversitet af sådanne molekyler.
For at studere sådanne små molekyler og al deres variation kræves der specielle metoder.Der er simple:for eksempel en organoleptisk analyse, som alle, der har taget en generel blod- eller urinprøve og set, at der er en streg "lugt, farve" i retningen, er stødt på. Når det er nødvendigt at finde et specifikt molekyle i en opløsning, tilsættes en dråbe af et forudvalgt reagens. Hvis der var et molekyle i opløsningen, vil der forekomme farvning; hvis det ikke var, vil der kun komme et bundfald. Blandt de simple metoder er der også optisk spektroskopi, hvor man med et mikroskop kan drage konklusioner ud fra sedimentets struktur. Ganske populære nu er immunokemiske metoder: dette er den samme ELISA-test for COVID-19.
Omics-undersøgelser er de undersøgelser, der studerer en komplet population.Og metabolomics indebærer analyse af storedata, der repræsenterer det komplette sæt af små molekyler i en organisme, celle eller organ. Sættet af disse data varierer i henhold til forskellige estimater fra flere tusinde, hvis vi kun betragter de primære metabolitter, til flere titusinder, hvis vi tilføjer sekundære metabolitter af kendte planter, bakterier og svampe til dem. Faktisk op til flere hundrede millioner, hvis vi tager højde for al den kemiske mangfoldighed, der kan komme ind i menneskekroppen. Og for at studere dem er der brug for specielle metoder: kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og massespektrometri.
I løbet af den 80-årige NMR-historie har forskere, der er involveret i denne metode, modtaget fem nobelpriser.Fire - for NMR, og den femte - forMR scanning. En metode lidt anderledes end NMR-spektroskopi, men meget ens i princippet. NMR-metoden er baseret på, at nogle atomer i det periodiske system har et magnetisk moment, der ikke er nul. De er små magneter og kan interagere med et eksternt magnetfelt. Denne interaktion manifesterer sig i opsplitning af energiniveauer. NMR-metoden gør det muligt at skelne mellem forskellige atomer og atomer af det samme grundstof, men i forskellige miljøer. For nylig har NMR mistet popularitet, primært på grund af dets høje omkostninger.
Hvordan man laver ladede partikler fra en kompleks blanding og finder ud af deres sammensætning
Massespektrometri er en metode til at adskille ladede partikler ved at interagere med et elektromagnetisk felt.Hvis vi tager nogle kompleks blanding bestående afforskellige ladede partikler, og næsten ethvert molekyle med moderne massespektrometrimetoder kan omdannes til en ladet form ved at tilføje en proton til den eller fjerne en proton fra den og anvende et elektromagnetisk felt på denne blanding, så vil partiklerne i dette felt begynde at bevæge sig, og de vil enten have hastighed eller en bane afhængig af massen. Lette partikler vil ankomme til detektoren tidligere end tunge. Efter behandling af dataene fra detektoren opnås et massespektrum, hvor der langs Y-aksen vil være signalintensitet, som er proportional med antallet af ioner, og langs X-aksen - massen i ionerne, eller rettere, forholdet mellem masse og ladning. Desuden giver massespektrometri dig mulighed for at måle masse med meget høj nøjagtighed. Det betyder, at det er muligt entydigt at fastslå grundstofsammensætningen af ionen, ladede partikler eller molekyle, hvoraf den er dannet. Matematisk kaldes dette at løse den diofantiske ligning i heltal: faktisk er dette et udvalg af koefficienter nær hvert atom: m(C), m(H), k(O), z(N). Og kun én kombination af heltal m, n, k, z kan give massen målt af massespektrometeret.
Metoden til massespektrometri blev foreslået i begyndelsen af det tyvende århundrede af Thompson.Forskere samlede verdens første massespektrometer ogmed sin hjælp gjorde han en stor opdagelse: han bekræftede eksperimentelt eksistensen af isotoper. På den anden side var han ikke i stand til at give en korrekt fortolkning af sine resultater. Hans elev William Aston gjorde dette for ham: i 1922 modtog han Nobelprisen for denne opdagelse. I det 20. århundrede udviklede massespektrometri sig på grund af en række verdenskrige som en metode for militæret. I begyndelsen af sin udvikling fandt den sin hovedanvendelse i den nukleare industri. Da massespektrometri kan adskille stoffer efter masse og bestemme isotoper, kan den bruges til at adskille isotoper som uran. Yderligere to Nobelpriser blev tildelt for massespektrometri: i 1989 - Wolfgang Paul og Hans Demelt, og derefter i 2002 - en ægte revolution blev udført uafhængigt af John Fenn og Kaishi Tanaka. De foreslog deres egen metode, der gør det muligt at opnå en ladet partikel fra et stort polymermolekyle: fra proteiner eller fra nukleinsyrer uden at ødelægge det. Dette satte gang i undersøgelsen. Nu kan ikke et eneste laboratorium - biokemisk eller molekylærbiologisk laboratorium - fungere uden eget massespektrometer eller uden et veludstyret fællesbrugscenter på instituttet.
Efter at have bestemt massen af en ion kan vi kun bestemme den grundlæggende sammensætning, men ikke molekylernes struktur.Fordi en elementær sammensætning af forskellige strukturer kan svare til et stort antal. Det vil sige, at atomerne i et molekyle kan arrangeres på forskellige måder. Dette kaldes fænomenet isomerisme.
Massespektrometrister er kommet op med en metode, der giver dig mulighed for at få lidt mere information om strukturen af et molekyle: en bestemt hindring placeres i vejen for flyvende accelererede molekyler.Normalt er disse gasmolekyler.Når molekylerne kolliderer med disse gasmolekyler, kan de bryde fra sammenstødet. Og så måler massespektrometeret ikke massen af det oprindelige molekyle, men af de stykker, som det brød op i. Og dette henfald sker ikke tilfældigt, men langs de svageste bindinger i molekylet. De resulterende fragmenter er identiske, og de er molekylære fingeraftryk: unikke for hvert molekyle.
Kromatografi er en metode til at adskille stoffer baseret på deres interaktion med sorbenter.Sorbenter er noget, der kan absorbereandre kemikalier, og det enkleste er aktivt kul, som vi tager ved forgiftning. I begyndelsen af det 20. århundrede demonstrerede den russiske videnskabsmand Mikhail Tsvet, at hvis et sådant naturligt farvestof føres gennem en søjle fyldt med kridt, vil du i stedet for en stor grøn udtværet plet få flere flerfarvede pletter: fra gul til grøn. Således indså han for det første, at det grønne farvestof fra bladene er en blanding af forskellige stoffer. Og for det andet opdagede han kromatografi, som i 1952 blev tildelt Nobelprisen for andre videnskabsmænd, der bragte hans metode til en moderne form. I moderne kromatografi føres en blanding gennem en søjle ved hjælp af en væske eller gas, afhængigt af typen af kromatografi. Væsken "trækker" molekylerne fremad, mod udgangen af søjlen, og sorbenten interfererer med hvert molekyle på forskellige måder. De ender med at forlade kolonnen på forskellige tidspunkter, som kan optages og bruges som et andet fingeraftryk til identifikation.
Fra cerebrospinalvæskeundersøgelse til tørblodsmetode
Massespektrometri er den eneste metode, der i øjeblikket er tilgængelig til undersøgelse af cerebrospinalvæske.I nogle vanskelige tilfælde for diagnosesygdomme, kræves en punktering, rygsøjlen gennembores, og der tages en prøve af cerebrospinalvæske. Men problemet er, at en person i gennemsnit kun har 120 ml cerebrospinalvæske. Og denne væske er under pres, så at tage selv 1 ml påvirker dette tryk markant og kan føre til irreversible konsekvenser for kroppen. Derfor kan der i virkeligheden kun udtages nogle få mikroliter. Ingen af de eksisterende metoder undtagen massespektrometri kan håndtere så små mængder af prøver, fordi jo mindre prøven er, jo færre molekyler har den, og jo mere følsomt skal dit udstyr være. Følsomheden af massespektrometri er normalt tilstrækkelig til dette. Efter indsamling fjernes prøven fra mekaniske indeslutninger og proteiner for at undgå udstyrsnedbrud. Efter analyse behandles resultatet ved hjælp af en computer, og en "liste over funktioner" opnås: outputtet er cirka 10-15 tusind linjer. Søjlerne producerer en formel, som vi definerer med en nøjagtig masse, en intensitet, der er proportional med mængden af det molekyle, og et "fingeraftryk".
Den mest direkte metode til at anvende dettemetabolomics massespektrometri eksperiment - sammenligner syge og raske mennesker for at identificere, hvilke molekyler der opstår, vises og ændre deres koncentration, når en sådan forskel opstår.Normalt er der to grupper:raske mennesker og mennesker med en sygdom af interesse for os, for eksempel med en bestemt form for onkologi. For hver prøve opnås sådanne plader, og derefter sammenligner og visualiserer matematikere dem for at finde forskelle mellem dem.
Den første anvendelse af massespektrometri er i neonatal screening.Hver nyfødt, efter ordre fra Sundhedsministeriet med2006, er de forpligtet til at teste for et bestemt sæt af arvelige sygdomme. Nu tester de under alle omstændigheder i Moskva for mindst 16 forskellige sygdomme. Der er sådanne sygdomme, og de viser sig ofte lige fra de første minutter af livet, som, hvis de ikke stoppes i tide, om en uge eller et par dage kan gøre barnet handicappet for livet. Derfor skal en sådan diagnostik foretages inden for de første par timer af en nyfødts liv. Biomarkørerne for næsten alle disse sygdomme er små molekyle metabolitter. Det vil sige, at sygdomme viser sig i form af forstyrrelser i stofskiftet, for eksempel ophobning af visse organiske syrer i blodet eller visse lipider. Og naturligvis forekommer denne ophobning i meget små koncentrationer; ud fra dem er det nødvendigt at erkende forskellen i ændringer i stofskiftet. Derfor, udover massespektrometri, vil ingen anden metode fungere her.
For at løse problemet med at indsamle blod fra børn (ikke så stor en mængde blod og børns frygt for invasive metoder og læger), kom de med en teknologi til at analysere tørrede blodpletter.Der laves en lille punktering og en eller flereto dråber blod direkte på et lille stykke filterpapir. Volumenet af blod her er flere mikroliter. Derefter tørres dette kort og sendes til laboratoriet, og afsendelsen er også meget praktisk: prøven behøver ikke at blive frosset eller optøet. Bare opløs dette kort igen til analyse, og inden for et par timer er analysen klar.
Et andet anvendelsesområde til massespektrometri er personlig medicin.Alle vores stoffer går til leveren, og leverenpå en eller anden måde metaboliserer dem. Desuden fungerer vores lever forskelligt for os alle, ikke kun på grund af nogle sygdomme eller dårlige vaner. For eksempel kan grapefrugtjuice påvirke dit stofskifte betydeligt; det hæmmer nogle enzymer, og som et resultat kan din koncentration af nogle lægemidler være flere gange højere end forventet. Nogle mennesker vil have denne koncentration i blodet efter at have taget stoffet, mens andre vil have den dobbelte koncentration. Det viser sig, at dosis skal halveres for ikke at forårsage unødvendig skade på kroppen. Derfor overgangen til personlig medicin. Du tager en pille, dit blod tages hver time, og de ser på kurven: hvordan stoffet bevæger sig gennem din krop over tid, hvad dets koncentration er i blodet. Så kan lægen justere dosis eller endda stoppe lægemidlet for dig og ordinere en anden. Og i dette tilfælde bruges tør blodanalyse også meget aktivt.
Ethvert nyt lægemiddel, der kommer på markedet, gennemgår nødvendigvis en metabolisk forskningsfase.Nogle lægemidler er muligvis ikke særlig giftige,men som følge af nedbrydning i leveren og nogle fejl, kan disse stoffer blive til endnu mere giftige. Det enkleste eksempel er paracetamol. Vejledningen til paracetamol siger, at det ikke bør gives til små børn. At små børn kun skal have ibuprofen. Og grunden til dette er akkumuleringen af dette molekyle i leveren, som som følge af metabolisme har en giftig effekt. For en voksen med en veludviklet lever er denne toksiske effekt ikke særlig mærkbar, selvom man selvfølgelig heller ikke skal synke paracetamol i glas. For små børn kan dette faktisk føre til alle mulige ubehagelige og endda irreversible konsekvenser. Derfor skal hvert nyt lægemiddel undersøges for stofskifte.
Billeddannelse er en måde at udføremassespektrometrisk analyse, når vi får information ikke kun om en homogen, men også om en heterogen prøve, og vi kan studere dens molekylære sammensætning i rummet.Der er et så interessant eksempel på at studeredistribution af lægemidlet og dets metabolitter i rottekroppen. Eksperimentet udføres som følger: En rotte får en bestemt medicin, efter et par timer aflives dyret, og derefter skæres dyret fint langs hele kroppen. Og så giver en speciel teknik til massespektrometri dig mulighed for at studere den molekylære sammensætning af hvert punkt i denne prøve. Efter computerbehandling er det muligt at visualisere, hvilke metabolitter der er akkumuleret. Det er vigtigt at undersøge fordelingen af metabolitter, for hvis du tager et lægemiddel mod lungebetændelse, er det vigtigt at det ender i lungerne og ikke i hjernen. En massespektrometrisk skalpel er en "kniv", der pumper molekyler ud af snitstedet, og derefter er det ved hjælp af computerteknologi muligt at bestemme, hvilken kirurg der skærer vævet: syg eller sund. Denne metode implementeres nu i USA, og den første virkelige operation med en sådan kniv er allerede udført.
Fingeraftryk for hvert molekyle
Problemet er, at flere hundrede eller endda tusinder af kemiske forbindelser kan svare til en grundlæggende sammensætning.Derfor er det nødvendigt at identificere alle rækkertabeller, og dette er hovedopgaven for moderne metabolomisk analyse; desværre er det ikke blevet fuldstændig løst. De molekylære fingeraftryk sammenlignes med dem, der findes i databaser over kemiske molekyler. Hvis de matcher, så kan vi med en vis tillid sige, at dette er det rigtige molekyle. Men sådanne databaser indeholder et meget begrænset antal stoffer. Den komplette fingeraftryksdatabase indeholder omkring 20-30 tusinde forbindelser; den dækker ikke engang alle de primære og sekundære metabolitter, der er til stede i den menneskelige krop. Der er et andet problem: For at genopbygge denne database har du brug for et rent kemisk stof, og de er normalt dyre. Det vil sige, at et rent kemikalie normalt koster flere tiere eller hundredvis af dollars.
En tilgang til identifikation er at skabe nye fingeraftryk.Eksempelvis bliver metoden nu aktivt udvikletionmobilitetsspektrometri. Mens massespektrometri deler ioner efter masse, gør ionmobilitet det muligt at adskille dem efter størrelse. Det vil sige, at hvis du har to løbere - ikke en tung og en let, men en stor og en lille, og lægger en form for forhindring på deres vej - for eksempel et net med celler, så vil en slank atlet kravle hurtigt gennem dette net og nå målstregen, men en fed en vil. Indtil han kommer ud af dette netværk, kommer han løbende efter noget tid.
Den anden metode er at forsøge at finde fingeraftryk, der ikke kræver rene standarder for at identificere.I laboratoriet foreslår vi at bruge den såkaldte isotopudveksling.
For eksempel, hvis vi ser på et sådant molekyle, såvi vil se, at det har hydrogenatomer forbundet med ilt. Så de er specielle. De kan forlade dette molekyle og vende tilbage til det. Hvis vi har dette molekyle opløst i vand, kan brint forlade molekylet, og brint kan vende tilbage fra vand. Og hvis vi ikke kun tager vand, men tungt vand, hvor der i stedet for brint er deuterium, så kan brint forlade molekylet, og deuterium kan indtage dets plads. Deuterium vides at adskille sig fra brint i molekylvægt pr. Enhed, og et massespektrometer kan se et sådant skift. Simpelthen ved at tælle antallet af sådanne hydrogener kan man sige, om dette er et nødvendigt eller unødvendigt molekyle, om vi identificerede det korrekt eller ej.
Kunstig intelligens kan bruges til at identificere molekyler.Baseret på de tilgængelige oplysninger kan du udfyldedatabaser med manglende information ved hjælp af deep learning-metoder. Det vil sige, at vi træner modellen, og den forudsiger de nødvendige fingeraftryk ud fra molekylets struktur, som vi så kan bruge til at sammenligne med, hvad der blev opnået i forsøget.
Se også:
Uranus har modtaget status som den mærkeligste planet i solsystemet. Hvorfor?
Mennesker kan modstå meget lave temperaturer, selv uden varmekilder
Fysikere har skabt en analog til et sort hul og bekræftet Hawkings teori. Hvor det fører hen?