Dmitry Madera, BIOCAD - wie CRISPR / Cas funktioniert und warum Mutationen auftreten

Dmitry Madera, Leiter der Abteilung für Molekulargenetik am BIOCAD, Senior Lecturer am SPCFU, Ph.D.

Im Jahr 2002 absolvierte er die Fakultät für Biologie der Moskauer Staatlichen Universitätmit Schwerpunkt Genetik. Er verteidigte seine Dissertation zum Doktor der Phylosophie in Biologie über das Programm zur Erforschung von Funktion und Genexpression an der Universität von Massachusetts. Danach arbeitete er an den National Institutes of Health, um die molekularen Aspekte der Krebsentstehung zu untersuchen und zu untersuchen, wie man sie beeinflusst. 2015 leitete er das molekulargenetische Labor bei BIOCAD und befasste sich seitdem mit der Entwicklung von Gentherapieprodukten. Der Autor eines internationalen Patents, das eine neue Nuklease der Cas9-Familie und Artikel auf dem Gebiet der Krebsentwicklung beschreibt.

Er Jiankui Experiment, Onkologierisiko bei Mädchen geboren und Zielmutationen

Was halten Sie von dem Experiment des chinesischen Biophysikers He Jiankui, der das Genom von zwei Embryonen editiert hat?ExpertenAnspruchdass geborene Mädchen Mutationen haben könnten. Wie vermeide ich das?Nachdem ich die Originalquelle (die MIT-Hi-Tech-Studie) und den Kommentar des Genetikers Fjodor Urnow studiert hatte, wurde mir klar, dass die Medien ein wenig verzerrt sindJa, bei Mädchen ist die Wahrscheinlichkeit höher, dass sie Mutationen haben.Damit sind jene Mutationen gemeint, von denen nicht bekannt ist, wo genau sie entstehen werden.Und jetzt ist es schwierig, genau festzustellen, wo die zufälligen Mutationen, die durch CRISPR/Cas9 entstanden sind, entstanden sind.Dazu müssen Sie einen Vergleich mit den Eltern der Mädchen anstellen.

Formal ist das eine korrekte Aussage: Es kann wirklich gezielte Mutationen geben, und man kann nichts dagegen tun.Und die derzeitigen Methoden der Genom-Editierung verhindern dies nicht.gefährlich sein.

Ende 2018 wurde der chinesische Wissenschaftler He Jiankuigab bekannt, dass er gentechnisch veränderte Zwillingsmädchen mit angeborener Immunität gegen HIV hervorbringen könne. Er sagte, er habe die Embryonen von Paaren bearbeitet, die sich einer IVF unterzogen hatten, und einer der sieben Versuche war erfolgreich. Das Experiment löste eine neue Welle von Diskussionen über die Ethik des Eingriffs in den genetischen Code des Menschen aus.

Allerdings Fedor Urnov, RedaktionsspezialistDas Genom der University of California stellte in einem Interview mit MIT Technology Review fest: „Die Behauptung, dass es das vorherrschende CCR5 reproduziert, ist eine offensichtliche Falschdarstellung“ und fügte hinzu, dass es nur als „absichtliche Falschdarstellung“ bezeichnet werden kann.

Eine neue Studie des MIT hat gezeigt, dass Wissenschaftler dies nicht tunkonnten die vorherrschende Version von CCR5 reproduzieren. Obwohl das Team auf das richtige Gen abzielte, kopierten die Forscher nicht die gewünschte Variante des Delta 32, sondern schufen neue Editionen, deren Wirkung nicht klar ist - obwohl sie Mutationen verursachen können.

Behauptung, dass He Jiankui nicht in der Lage war, das CCR5-Gen (das Gen, das es ermöglicht,Es hat tatsächlich sein Ziel erreicht, und CCR5 ist in der Tat mutiert und funktioniert nicht mehr, was bedeutet, dass HIV menschliche Zellen nicht infizieren kann.Ja, es ist anscheinend nicht gelungen, ein bestimmtes natürliches Allel zu replizieren, das in menschlichen Populationen vorkommt, aber dennoch ist CCR5 "ausgeschaltet" und funktioniert nicht, was bedeutet, dass Jiankui das Minimalziel erreicht hat.

Um Zielmutationen zu verhindern,Es ist notwendig, die Methoden zur Bearbeitung des Genoms zu verbessern, um deren Genauigkeit zu erhöhen. So wird es zukünftig möglich sein, das Risiko von Mutationen auf das Hintergrundniveau zu reduzieren und sich dann davon zu beruhigen, dass Mutationen auf natürliche Weise auftreten. Es ist nicht notwendig, heiliger als der Papst zu sein.

- Das heißt, wenn diese Mädchen erwachsen werden, ist es unrealistisch, genau zu verstehen, welche Mutationen sie als Ergebnis der Aktionen von Jiankui hatten?

- Wenn ich speziell über CCR5 spreche, dann natürliches ist möglich. Und für das ganze Genom - im Prinzip ist es jetzt möglich, wenn man das Erbgut von Vater und Mutter mit dem eigenen vergleicht. Dann wird klar, welche Möglichkeiten Eltern haben und welche von denen, die im Genom der Mädchen vorhanden sind, weder Mama noch Papa haben. Eine andere Sache ist, dass es unmöglich sein wird, herauszufinden, welche Mutationen infolge von CRISPR / Cas entstanden sind und welche zufällig. Sie können nur die Häufigkeit dieser Mutationen vergleichen: Wie viele normale Mutationen treten bei der Geburt auf und wie viele dieser Mädchen haben sie. Wenn es eine Größenordnung mehr geben wird, ist alles klar.

Die CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie hat das Potenzial, Tausende von Erbkrankheiten zu eliminieren, die bisher als unheilbar galten.

Der Hauptunterschied zwischen einem Gen-ToolBearbeitung von CRISPR / Cas9 aus anderen, lang genug vorhandenen Methoden - dies ist die Möglichkeit von gerichteten DNA-Änderungen. Mit CRISPR / Cas9 können Sie die DNA-Sequenz gezielt beeinflussen und sogar das defekte Gen in das richtige umwandeln. Zu diesem Zweck führt ein spezielles Enzym, Nuklease, eine Lücke an der richtigen Stelle im Genom ein, wonach das Reparatursystem aktiviert wird - die internen Mechanismen der Zelle zur Wiederherstellung des Genoms. In diesem Fall wird die DNA in der Regel am Ort des Bruchs mit zufälligen Fehlern repariert, was höchstwahrscheinlich zum Verlust oder zur Einfügung mehrerer Buchstaben in die Sequenz und zum Auftreten von Mutationen führt. Daher sucht sie als Probe nach der gewünschten Sequenz in benachbarten Genomen. Technologisch gesehen muss die Zelle diese Sequenz in speziellen DNA-Fragmenten finden. Ihre Genetik wird in die Zelle eingeführt, um sie aufzunehmen und selbständig in sich selbst einzuführen. Zufällige Mutationen an der Bruchstelle treten jedoch viel häufiger auf als eine gezielte Reparatur entlang der Probe.

Eine andere Frage: Konstantin Severinov (ein russischer Spezialist auf dem Gebiet der Molekularbiologie und CRISPR/Cas – Hitech) äußerte einmal die interessante Idee, dass, wenn es dort etwas völlig Schreckliches gäbe, die Mädchen im Stadium der Embryogenese einfach nicht überlebt hätten.Höchstwahrscheinlich wurde nichts Grundlegendes an ihrem Genom beeinflusst.Das Einzige, was mir Angst macht, ist die Onkologie.ähnlichen Krankheiten.

- Warum? Wird die Onkologie durch die Bearbeitung des menschlichen Genoms wahrscheinlicher?

Werfen wir einen Blick auf die Ursachen von Krebs: Es gibt drei davon: erbliche Mutationen, d.h. spezielle Allele, diedie Wahrscheinlichkeit eines erhöhten Krebsrisikos, wie z. B. Angelina Jolie; virale Ursachen – z. B. humane Papillomaviren; und zufällige Mutationen.Es ist das Auftreten von Mutationen des letzteren Typs bei den Mädchen im chinesischen Experiment, vor dem ich Angst habe, besonders wenn es eine hohe Häufigkeit von Mutationen gab.In diesem Fall ist die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Tumors nicht gleich Null.

Dmitrij Madera. Foto: Science Bar Hopping

Wie man das menschliche Genom, die führenden Länder und das Schicksal der russischen Genetik bearbeitet

- Wie viel einfacher ist es, solche Experimente mit Tieren durchzuführen?

— Um das Genom jedes Tieres zu bearbeitenSie benötigen Ihr eigenes Protokoll. Sie müssen eine Maus oder eine Kuh mit unterschiedlichen Protokollen bearbeiten. Und der Mensch benötigt wie jedes andere Tier seine Entwicklung für sich, um sein Genom möglichst effektiv bearbeiten zu können. Daher kann man nicht sagen, dass es schwieriger ist, eine Person zu bearbeiten als eine Kuh. Sie müssen es nur anders machen als mit einer Maus oder Ratte. Aber die Ansätze bleiben die gleichen. Es gibt bei uns nichts Großes, das anders ist.

- AlsoDas Problem liegt nur im Bereich der Ethik und Gesetze? Und wenn es entschieden würde, gäbe es mehr Experimente?

- Zweifellos.Und dann gibt es tatsächlich noch eine Menge Experimente. Ich gehe zu Konferenzen und treffe oft Kollegen. Beispielsweise führt die University of Oregon hervorragende Experimente zur Bearbeitung des menschlichen Genoms und zur Züchtung von Embryonen durch. Sie werden einfach nachträglich zu einem bestimmten, frühen Zeitpunkt zerstört. Solche Experimente sind nicht verboten. Tatsächlich besteht die einzige Einschränkung in der Einnistung eines Embryos und seiner Kultivierung bis zur Geburt.

- Welche Länder sind heute führend in der Erforschung der Bearbeitung des menschlichen Genoms?

— Es gibt jetzt zwei solcher Führer, zwischen ihnen und allen anderenDer Rest ist ein absoluter Abgrund. Dies sind die USA und China. Niemand ist noch näher dran, sie sind in ihrer Forschung so weit vom Rest der Welt entfernt.

- Hat es mit Finanzierung oder wissenschaftlicher Basis zu tun?

- Mit beiden.China investiert viel Geld in die Forschung, die Regierung ist darüber sehr besorgt. Und wenn sie früher lediglich Technologie kopierten, machen chinesische Wissenschaftler jetzt interessante Dinge. Und in den USA gibt es einfach eine sehr starke wissenschaftliche Basis. Wo wurden eigentlich all diese CRISPR/Cas entdeckt? Die meisten Entdecker dieser Methode, bis auf Jennifer Doudna, sind Chinesen, arbeiten aber in den USA. Daher gab es eine solche Synergie zwischen den beiden Ländern.

— Was hindert Russland daran, sich in diesem Bereich zu entwickeln? Sogar der Präsidenterklärtüber die Priorität der Forschung in Richtung Genetik.

- Ich werde das sagen, heute gibt es bereits FinanzierungForschung - viel Geld wird zugewiesen. Aber das alles ist natürlich nicht in einer Stunde erledigt. Wir brauchen eine wissenschaftliche Basis und eine Schule. In Russland ist in Bezug auf die Genetik nach dem Lysenkoismus alles traurig. Vor Lysenko war die sowjetische Genetikschule eine der besten der Welt. Vavilov ging zu Morgan (Thomas Morgan - einer der Gründer der Genetik, der Nobelpreisträger - High Tech) und sie kommunizierten zu gleichen Bedingungen. Nach Lysenko wurde alles barbarisch zerstört. Und seitdem können wir uns nicht mehr erholen. Ja, Geld ist sehr wichtig. Es ist aber auch notwendig, dass die Kinder zum Lernen gehen, damit ausländische Fachkräfte einbezogen werden. Und wenn es eine Schule gibt, wird es in Russland eine genomische Bearbeitung geben.

- Wie wird dies durch die jüngsten Empfehlungen zur Kommunikation zwischen russischen und ausländischen Wissenschaftlern beeinflusst - alle Kontakte zu melden, praktisch zu kommunizieren, wie in der Sowjetunion?

- Das ist sehr beängstigend. Das Schlimmste, was für die russische Wissenschaft getan werden kann, um sie vollständig zu töten, sind diese Empfehlungen. Und ich verstehe, dass dies nur Empfehlungen sind und nicht befolgt werden müssen. Aber die Leute haben Angst. Und sie fangen an, sie proaktiv auszuführen. Vor allem nicht Wissenschaftler, sondern Bürokraten aus der Wissenschaft. Sie werden aufhören, mit ausländischen Wissenschaftlern zu kommunizieren. Ich kenne die Geschichte, als Kommilitonen aus Deutschland einmal zu einer Konferenz in Russland kamen und ausländische Wissenschaftler nicht oft zu uns kamen und sie aufgrund dieser Anforderungen nicht zur Veranstaltung zugelassen wurden. Wissenschaft ist international, und Sie müssen so viel wie möglich mit Kollegen kommunizieren und interagieren, und dann wird es gut. Ich verurteile diese Forderungen nachdrücklich.

Behandlung von Taubheit, gefährlichen Krankheiten und Medikamentenabgabe

— Russischer Genetiker Denis Rebrikovgehen zuBearbeiten des Genoms von Embryonen für Paare mit Hörbehinderungen. Wie wahrscheinlich ist der Erfolg eines solchen Experiments?

— Denis Wladimirowitsch hat alle seine Fehler berücksichtigtChinesischer Kollege. Er wird die Sequenzierung des gesamten Genoms durchführen. Und das Experiment selbst wird in einer kontrollierteren Umgebung stattfinden, nicht unter halbunterirdischen Bedingungen, wie es bei Jiankui der Fall war. Ich denke, dass Erfolg aus methodischer Sicht grundsätzlich möglich ist, und es stellt sich heraus, dass nicht alles so beängstigend ist, insbesondere wenn man moderne Methoden verwendet. Und das Ausmaß der Mutation kann auf dem Hintergrundniveau liegen. Was diese kranken Kinder betrifft, ja, das ist eine monogene Mutation, und sie ist dominant, das heißt, sie lässt sich ziemlich leicht zerstören, was Genetikern bereits gut gelingt. Und tatsächlich, dem steht dem weiteren Weg nichts mehr im Wege.

— Wie passt das zur russischen Gesetzgebung?

- In Bezug auf die rechtlichen Aspekte, Rebrikoves funktioniert einfach so. In diesem Sinne ist es sehr interessant zu wissen, was dort passiert. Ich möchte wirklich, dass es ihm gelingt, diese gesetzgeberische Mauer zu durchbrechen. Obwohl sein Beispiel und die Krankheit, die er gewählt hat, nach Meinung vieler meiner Kollegen und meiner nicht so relevant sind. Aber das Feld öffnet sich riesig, also sei es das erste und zeige ein gutes Ergebnis. Außerdem wird es möglich sein, das "Repertoire" zu erweitern.

- Welche anderen gefährlichen Krankheiten können mit CRISPR / Cas behandelt werden?

— Natürlich ist Mukoviszidose eine sehr ernste AngelegenheitKrankheit. Es ist möglich, die Genbearbeitung bei der Behandlung der Duchenne-Muskeldystrophie einzusetzen, zumindest bei einigen Patienten, die eine dafür mehr oder weniger geeignete Mutation haben. Im Allgemeinen gibt es mehr als 10.000 monogene genetische Erkrankungen. Und hier stellt sich die Frage, welche Methode bequemer und einfacher zu behandeln ist. Beispielsweise sollte die spinale Muskelatrophie nicht mit einer Editierung, sondern lediglich mit einer Genersatztherapie behandelt werden.

Mukoviszidose- systemische Erbkrankheit,wird durch eine Mutation im Gen für den Transmembranregulator der Mukoviszidose verursacht und ist durch eine Schädigung der exokrinen Drüsen und eine schwere Funktionsstörung der Atmungsorgane gekennzeichnet. Mukoviszidose ist nicht nur aufgrund ihrer weiten Verbreitung von besonderem Interesse, sondern auch, weil sie eine der ersten Erbkrankheiten war, die behandelt wurde. Mukoviszidose wurde erstmals 1938 von Dorothy Andersen als eigenständige Erkrankung erkannt.

Duchenne-Myodystrophie- verursacht durch Löschungen oder Duplikate von einemoder mehrere Exons oder Punktmutationen im Dystrophin-Gen. Die Hauptsymptome sind Muskelschwäche und Bewegungsschwierigkeiten seit der Kindheit, die mit der Zeit fortschreiten. Der Tod tritt meist im zweiten oder dritten Lebensjahrzehnt ein. Die durchschnittliche Dauer beträgt 25 Jahre, es gibt jedoch Menschen, die länger leben.

- Wann können Wissenschaftler dies tun? Was ist die Zeitspanne?

- Schauen Sie, die Tiere werden bereits behandelt.Stimmt, zuerst „verstümmeln“ sie natürlich (das heißt, sie stellen Modelltiere her, um Krankheiten zu untersuchen), und dann behandeln sie. All dies geschieht jedoch nur in einer bewussten Klinik und dauert in der Regel 5 bis 15 Jahre. Und da es sich um einen völlig neuen Ansatz handelt, werden die ersten klinischen Studien meines Wissens nach sehr lange dauern. Das bedeutet, dass wir 15 bis 20 Jahre warten müssen. Dann sieht es so aus: Kommen Sie, lassen Sie sich sofort diagnostizieren und behandeln.

Dmitry Madera. Foto: Wissenschafts-Stab-Hopfen

- Das heißt, es geht nicht um die Bearbeitung des Genoms der Embryonen, sondern um die Behandlung von Erwachsenen?

— Beide Ansätze werden möglich sein.

- Lass uns reden überGen-Bearbeitungohne doppeltes Brechen. Warum konnten Wissenschaftler das früher nicht tun?

„Die Sache ist, es ist überhaupt nicht einfach.“Als ich die Nature-Publikation zum ersten Mal las, dachte ich: „Oh, wie konnte ich nicht daran denken?“ Spaß beiseite, es war eine Menge Arbeit, denn ursprünglich gab es eine ähnliche Idee, aber als Wissenschaftler sie ausprobierten, hatten sie keinen Erfolg. Dann begannen sie, die Reverse Transkriptase zu verändern, indem sie sie im Wesentlichen mutierten, damit sie anders funktionierte. Und schon bei einer bestimmten Iteration begann es zu funktionieren und begann, so etwas zu produzieren. Es war ein Prozess, der viel Zeit und Geld erforderte. Deshalb wundert es mich nicht, dass zwischen der Erfindung von CRISPR/Cas und dem Aufkommen der Methode, die Reverse Transkriptase verwendet, Zeit verging. Weil es nicht trivial ist.

- Welche Möglichkeiten eröffnen sich durch diese neue Methode?

- Die Chancen sind groß, denn jetztes stellt sich heraus, dass wir mit minimalem Risiko des Auftretens von Zielmutationen jedes Gen, Allel, sehr spezifisch verändern können. Wenn Sie beispielsweise eine Punktmutation erstellen möchten, erstellen Sie eine Löschung oder eine komplexe Ersetzung. Dies gibt uns große Chancen, da im Großen und Ganzen gewöhnlich eine oder zwei auftretende Mutationen oder Deletionen klein sind und sie innerhalb von 40-50 Nukleotiden wiederhergestellt werden können.

In der Tat gab es Technologien ein bisschen früher -Nucleotid-Editoren, die einfach "A" durch "G" oder "C" durch "T" ersetzt haben. Solche Werke wurden und werden immer noch verwendet, aber natürlich ist dort nicht alles einfach, denn es stellt sich heraus, dass sie nicht nur DNA, sondern auch RNA bearbeiten, und sie sagen nicht, dass sie sehr genau sind - sie bearbeiten nicht genau ein Nukleotid und das ganze "Fenster". Vielleicht wird sich dies auch später zum praktischen Nutzen entwickeln. Bisher gibt es jedoch viele Probleme. Ich habe mich an diese Methode erinnert, weil es auch keine doppelsträngigen Pausen gibt. Und es ist etwas früher entstanden als diese jüngsten Studien.

— Ingenieure der Universitäten MIT und HarvardbenutztCRISPR soll ein Medikamentenverabreichungssystem schaffen, das diese nur zu einem bestimmten Zeitpunkt freisetzt. Wie genau geschieht das?

- Speziell über diese Methode sprechen, dann esDas Wesentliche ist, dass DNA ein Polymer ist und Cas12a es schneidet, wodurch die Polymerstruktur zerstört wird. Wenn DNA in das Hydrogel eingebaut wird, werden Substanzen freigesetzt, die zuvor mit DNA-Strängen im Hydrogel fixiert wurden. Das heißt, hier wirkt DNA einfach als physikalisches Material, das auf kontrollierte Weise zersetzt werden kann. Im Allgemeinen werden Hydrogele bei Wunden und anderen Verletzungen eingesetzt, wenn eine schrittweise Freisetzung von Arzneimitteln aus diesen erforderlich ist.

Im Prinzip könnte CRISPR/Cas etwas liefernnotwendig für eine Position im Genom. Das ist alles, was er tun kann. Aber es kann das Medikament nicht in die Zelle transportieren. Daher ist es nicht ganz richtig, über seine Verwendung zur Arzneimittelverabreichung zu sprechen.

Aber CRISPR / Cas als zu liefernMedikamente in die Zelle, Abgabemethoden sind erforderlich. Und sie existieren - sie können viral und nicht viral sein. Viren haben sich natürlich im Laufe ihrer Geschichte weiterentwickelt, um der Zelle bestimmtes genetisches Material zuzuführen. Sie vermehren sich so. Und nicht-virale Methoden sind einfach chemische Methoden, wenn einige Träger erzeugt werden, die in sich Nukleinsäuremoleküle enthalten, nicht unbedingt DNA, übrigens kann es sogar RNA oder Protein sein. Normalerweise sind es einige Fetttröpfchen, die schützen, was sie von Nukleasen und Proteasen abgeben müssen, und Antikörper können auch an sie gehängt werden, um ihnen Spezifität für eine bestimmte Zelle zu verleihen. Und diese lipophilen Komplexe liefern Medikamente an die Zelle. Und es gibt Arbeiten, die sich auf komplexe Polymere oder Goldnanopartikel beziehen, die wie eine Kanone Brandzellen verbrennen, in sie hineinfliegen und ihren Inhalt liefern, wie beispielsweise eine genomische Kanone.

- Ist es möglich, das Leben eines Menschen dank der Bearbeitung von Genen erheblich zu verlängern? Wie viel kann dies getan werden und welche Krankheiten müssen auf diese Weise geheilt werden?

- Schwere Frage.Tatsache ist, dass es Mutationen gibt, die bei Tieren eine gewisse Lebensverlängerung, eine Verlangsamung des Alterns, bewirken. Sie sind normalerweise mit dem DNA-Reparatursystem verbunden. Alterung ist in vielerlei Hinsicht eine Folge der Anhäufung zufälliger Fehler, die zur Aktivierung retroviraler Elemente führen. Infolgedessen wird das Genom nicht reguliert und beginnt, gegen seinen Wirt zu arbeiten. Hier gibt es einen Punkt: Wir wissen nicht, wie es bei Menschen funktionieren wird. Leider, und das war eine große Überraschung, sind die Mechanismen des Alterns und des Schutzes dagegen sehr artspezifisch. Und für den Menschen erweisen sich dieselben Mäuse als nicht ganz geeignetes Modell. Und je adäquater das Modell ist und je länger es lebt, desto schwieriger ist es, damit zu arbeiten. Zum Beispiel das gleiche SIRT6 – bei langlebigen Arten ist es eins, bei kurzlebigen Arten ist es unterschiedlich, es gibt eine klare Korrelation. Es schien, als würde man SIRT6 von einem Elefanten zu einer Person nehmen und einfügen. Oder mehrere Kopien des menschlichen SIRT6 (das Gen, das das Sirtuin-6-Protein kodiert, hilft bei der Korrektur von DNA-Schäden – Doppelstrangbrüchen und Substitutionen in genetischen Nukleotidbuchstaben – Hi-Tech). Das kann funktionieren, vielleicht auch nicht. Es gibt eine solche Möglichkeit, und natürlich würde ich es versuchen. Aber wenn wir über die Verlängerung des Lebens sprechen, müssen wir höchstwahrscheinlich Gene bearbeiten, die mit der DNA-Reparatur verbunden sind. Für einen solchen Organismus wie den Menschen ist dies heute jedoch nur noch eine Hypothese.