Die RNA wurde in lebenden Zellen mit ultrahoher Auflösung sichtbar gemacht

Die Methode basiert auf einem neuen molekularen Marker namens Rhodamin-bindendem Aptamer für Methoden

Super-Resolution-Bildgebung (RhoBAST).Dieser RNA-basierte Fluoreszenzmarker wird in Kombination mit dem Farbstoff Rhodamin verwendet. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften interagieren Marker und Farbstoff auf ganz spezifische Weise, wodurch einzelne RNA-Moleküle zum Leuchten gebracht werden. Anschließend können sie mithilfe der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM), einem hochauflösenden Bildgebungsverfahren, sichtbar gemacht werden. Aufgrund des Mangels an geeigneten Fluoreszenzmarkern war die direkte Beobachtung von RNA mittels optischer Fluoreszenzmikroskopie bisher stark eingeschränkt.

RhoBAST wurde von Forschern des Instituts entwickeltfür Pharmazie und Molekulare Biotechnologie (IPMB) an der Universität Heidelberg und am Institut für Angewandte Physik (APH) am KIT. Der von ihnen erstellte Marker ist genetisch kodiert, was bedeutet, dass er mit dem Gen jeder von der Zelle produzierten RNA fusioniert werden kann. RhoBAST selbst ist nicht fluoreszierend, sondern beleuchtet den zelldurchlässigen Rhodamin-Farbstoff und bindet ihn auf ganz spezifische Weise.

„Das führt zu einem starken Anstieg.“Fluoreszenz, die durch den RhoBAST-Komplex erreicht wird, was eine Schlüsselvoraussetzung für die Erzielung hervorragender Fluoreszenzbilder ist. Für die hochauflösende RNA-Bildgebung benötigt der Marker jedoch zusätzliche Eigenschaften.“

Murat Zunbül vom IPMB

Die Forscher fanden heraus, dass jedes MolekülDer Rhodaminfarbstoff bleibt nur etwa eine Sekunde an RhoBAST gebunden, bevor er sich wieder ablöst. Nach einigen Sekunden wird dieser Vorgang mit einem neuen Farbstoffmolekül wiederholt. Es ist ziemlich selten, dass beispielsweise starke Wechselwirkungen zwischen RhoBAST und Rhodamin in Kombination mit einer extrem schnellen Stoffwechselkinetik auftreten. Da Rhodamin erst nach Bindung an RhoBAST aufleuchtet, führt die konstante Abfolge von wieder auftretenden Wechselwirkungen zwischen dem Marker und dem Farbstoff zu einem kontinuierlichen „Blinken“. Dieses Ein-Aus ist genau das, was Sie zum Rendern benötigen.

Gleichzeitig löst das RhoBAST-System ein anderesein wichtiges Problem. Fluoreszenzbilder werden durch Belichtung mit Laserlicht gesammelt, das im Laufe der Zeit die Farbstoffmoleküle abbaut. Ein schneller Farbstoffwechsel stellt sicher, dass photobleiche Farbstoffe durch frische ersetzt werden. Dies bedeutet, dass einzelne RNA-Moleküle über längere Zeiträume beobachtet werden können, was die Bildauflösung erheblich verbessern kann.

Forscher aus Heidelberg und Karlsruhe konntendemonstrieren die überlegenen Eigenschaften von RhoBAST durch Visualisierung von RNA-Strukturen in Darmbakterien (Escherichia coli) und kultivierten menschlichen Zellen mit überlegener Lokalisierungsgenauigkeit. Mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie konnten Wissenschaftler Details bisher unsichtbarer subzellulärer Strukturen und molekularer Wechselwirkungen mit RNA aufdecken. Dies wird ein grundlegend neues Verständnis der biologischen Prozesse ermöglichen.

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