Εφαρμογή της γενετικής μηχανικής στην επιστημονική έρευνα
- Νοκ άουτ
Να μελετήσει τη λειτουργία του ενός ή του άλλου
Για νοκ-άουτ, το ίδιο γονίδιο ή το θραύσμα του συντίθεται, τροποποιείται έτσι ώστε το γονιδιακό προϊόν να χάσει τη λειτουργία του. Βασικές μέθοδοι υλοποίησης: ψευδάργυρος, μορφολίνο και TALEN.
Για να αποκτήσετε νοκ-άουτ ποντίκια, τα αποκτήθηκανΤο γενετικά τροποποιημένο κατασκεύασμα εισάγεται σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, όπου το κατασκεύασμα υφίσταται σωματικό ανασυνδυασμό και αντικαθιστά το φυσιολογικό γονίδιο, και τα τροποποιημένα κύτταρα εμφυτεύονται στην βλαστοκύστη της υποκατάστατης μητέρας. Στη μύγα των φρούτων, οι μεταλλάξεις της Drosophila ξεκινούν σε έναν μεγάλο πληθυσμό, στον οποίο αναζητούνται απόγονοι με την επιθυμητή μετάλλαξη. Τα φυτά και οι μικροοργανισμοί αποκλείονται με παρόμοιο τρόπο.
- Τεχνητή έκφραση
Μια λογική προσθήκη στο νοκ-άουτ είναιτεχνητή έκφραση, δηλαδή την προσθήκη ενός γονιδίου στο σώμα που δεν είχε προηγουμένως. Αυτή η τεχνική γενετικής μηχανικής μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων. Στην ουσία, η διαδικασία εισαγωγής επιπρόσθετων γονιδίων είναι η ίδια με εκείνη του νοκ-άουτ, αλλά τα υπάρχοντα γονίδια δεν αντικαθίστανται ή καταστρέφονται.
- Οπτικοποίηση γονιδιακού προϊόντος
Χρησιμοποιείται όταν η εργασία είναι να μελετήσειεντοπισμός του γονιδιακού προϊόντος. Μία από τις μεθόδους επισήμανσης είναι η αντικατάσταση του κανονικού γονιδίου με ένα συγχωνευμένο με ένα στοιχείο αναφοράς, για παράδειγμα, με το γονίδιο πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP. Αυτή η πρωτεΐνη, η οποία φθορίζει στο μπλε φως, χρησιμοποιείται για την οπτικοποίηση του προϊόντος της γενετικής τροποποίησης.
Ενώ αυτή η τεχνική είναι βολική και χρήσιμη, οι παρενέργειές τηςΟι συνέπειες μπορεί να είναι μερική ή ολική απώλεια της λειτουργίας της πρωτεΐνης που μελετάται. Μια πιο εξελιγμένη, αν και όχι τόσο βολική, μέθοδος είναι να προσθέσετε στην υπό μελέτη πρωτεΐνη όχι τόσο μεγάλα ολιγοπεπτίδια που μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα.
- Διερεύνηση του μηχανισμού έκφρασης
Σε τέτοια πειράματα, το καθήκον είναι η μελέτησυνθήκες γονιδιακής έκφρασης. Τα χαρακτηριστικά έκφρασης εξαρτώνται κυρίως από ένα μικρό κομμάτι DNA που βρίσκεται μπροστά από την κωδικοποιητική περιοχή, που ονομάζεται προαγωγέας, το οποίο χρησιμεύει για τη σύνδεση παραγόντων μεταγραφής.
Αυτός ο ιστότοπος εισάγεται στο σώμα τοποθετώντας μετάαντί για το δικό του γονίδιο αναφοράς, για παράδειγμα, το GFP ή ένα ένζυμο που καταλύει μια εύκολα ανιχνεύσιμη αντίδραση. Εκτός από το γεγονός ότι η λειτουργία του υποκινητή σε ορισμένους ιστούς ταυτόχρονα γίνεται αισθητή, τέτοια πειράματα καθιστούν δυνατή τη μελέτη της δομής του υποκινητή αφαιρώντας ή προσθέτοντας θραύσματα DNA σε αυτόν, καθώς και τεχνητά βελτιώνοντας τις λειτουργίες του.
Γιατί απαιτείται ανθρώπινη γενετική μηχανική;
Όταν εφαρμόζεται στους ανθρώπους, η γενετική μηχανική θα μπορούσεχρησιμοποιείται για τη θεραπεία κληρονομικών ασθενειών. Ωστόσο, τεχνικά, υπάρχει μια σημαντική διαφορά μεταξύ της θεραπείας του ίδιου του ασθενούς και της τροποποίησης του γονιδιώματος του απογόνου του.
Το έργο της αλλαγής του γονιδιώματος των ενηλίκωνείναι κάπως πιο περίπλοκο από την αναπαραγωγή νέων γενετικά τροποποιημένων φυλών ζώων, καθώς σε αυτή την περίπτωση είναι απαραίτητο να αλλάξει το γονιδίωμα πολλών κυττάρων ενός ήδη σχηματισμένου οργανισμού και όχι μόνο ενός εμβρυϊκού ωαρίου. Για να γίνει αυτό, προτείνεται η χρήση ιικών σωματιδίων ως φορέας.
Τα ιικά σωματίδια μπορούν να διεισδύσουν σεένα σημαντικό ποσοστό ενηλίκων κυττάρων, ενσωματώνοντας τις κληρονομικές τους πληροφορίες σε αυτά. είναι δυνατή η ελεγχόμενη αναπαραγωγή ιικών σωματιδίων στο σώμα. Ταυτόχρονα, για να μειώσουν τις παρενέργειες, οι επιστήμονες προσπαθούν να αποφύγουν την εισαγωγή γενετικά τροποποιημένου DNA στα κύτταρα των γεννητικών οργάνων, αποφεύγοντας έτσι τις επιπτώσεις στους μελλοντικούς απογόνους του ασθενούς.
Αξίζει επίσης να σημειωθεί η σημαντική κριτική αυτής της τεχνολογίας στα μέσα ενημέρωσης: η ανάπτυξη γενετικά τροποποιημένων ιών θεωρείται από πολλούς ως απειλή για όλη την ανθρωπότητα.
Με τη βοήθεια της γονιδιακής θεραπείας, είναι δυνατόν στο μέλλον να αλλάξει το ανθρώπινο γονιδίωμα. Επί του παρόντος, αποτελεσματικές μέθοδοι για την τροποποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος βρίσκονται στο στάδιο ανάπτυξης και δοκιμής σε πρωτεύοντα.
Μακροχρόνια γενετική μηχανική πιθήκωναντιμετώπισε σοβαρές δυσκολίες, αλλά το 2009 τα πειράματα στέφθηκαν με επιτυχία: μια δημοσίευση εμφανίστηκε στο περιοδικό Nature σχετικά με την επιτυχή χρήση γενετικά τροποποιημένων ιικών φορέων για τη θεραπεία ενός ενήλικα αρσενικού πιθήκου από αχρωματοψία. Την ίδια χρονιά, το πρώτο γενετικά τροποποιημένο πρωτεύον (που αναπτύχθηκε από ένα τροποποιημένο αυγό) γέννησε απογόνους. - κοινή μαρμοζέτα (Callithrix jacchus).
Αν και σε μικρή κλίμακα, η γενετική μηχανική έχει ήδηχρησιμοποιείται για να δώσει σε γυναίκες με συγκεκριμένους τύπους υπογονιμότητας την ευκαιρία να μείνουν έγκυες. Για αυτό χρησιμοποιούνται ωάρια από υγιή γυναίκα. Ως αποτέλεσμα, το παιδί κληρονομεί τον γονότυπο από έναν πατέρα και δύο μητέρες.
Ωστόσο, η δυνατότητα εισαγωγής πιο σημαντικήΟι αλλαγές στο ανθρώπινο γονιδίωμα αντιμετωπίζουν ορισμένα σοβαρά ηθικά προβλήματα. Το 2016, μια ομάδα επιστημόνων στις Ηνωμένες Πολιτείες έλαβε έγκριση για κλινικές δοκιμές μιας μεθόδου θεραπείας καρκίνου χρησιμοποιώντας τα ανοσοκύτταρα του ίδιου του ασθενούς, τα οποία γενετικά τροποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την τεχνολογία CRISPR / Cas9.
Στα τέλη του 2018, δύο παιδιά γεννήθηκαν στην Κίνα,του οποίου το γονιδίωμα άλλαξε τεχνητά (το γονίδιο CCR5 απενεργοποιήθηκε) στο εμβρυϊκό στάδιο χρησιμοποιώντας τη μέθοδο CRISPR/Cas9, ως μέρος της έρευνας που διεξάγεται από το 2016 για την καταπολέμηση του HIV. Ο ένας από τους γονείς (πατέρας) ήταν μολυσμένος με τον ιό HIV και τα παιδιά, σύμφωνα με τη δήλωση, γεννήθηκαν υγιή.
Εφόσον το πείραμα δεν ήταν εξουσιοδοτημένο (πρινΕπομένως, όλα αυτά τα πειράματα σε ανθρώπινα έμβρυα επιτρέπονταν μόνο στα αρχικά στάδια ανάπτυξης με την επακόλουθη καταστροφή του πειραματικού υλικού, δηλαδή χωρίς εμφύτευση του εμβρύου στη μήτρα και τη γέννηση παιδιών), ο επιστήμονας που ήταν υπεύθυνος γι' αυτό. δεν παρέχει στοιχεία για τις δηλώσεις του, οι οποίες έγιναν σε διεθνές συνέδριο για την επεξεργασία του γονιδιώματος.
Στο τέλος Ιανουαρίου 2019, οι κινεζικές αρχές επιβεβαίωσαν επίσημα τα γεγονότα αυτού του πειράματος. Εν τω μεταξύ, απαγορεύτηκε στον επιστήμονα να συμμετάσχει σε επιστημονικές δραστηριότητες και συνελήφθη.
Πώς επεξεργάζεται το ανθρώπινο γονιδίωμα;
- Μέθοδος δακτύλων ψευδαργύρου
Τα "δάχτυλα ψευδαργύρου" βρίσκονται επίσης στη σύνθεσηανθρώπινες πρωτεΐνες. Χάρη σε αυτήν τη μέθοδο, είναι δυνατό να σχεδιαστεί η αλυσίδα ZFN έτσι ώστε να αναγνωρίζει ένα συγκεκριμένο τμήμα του DNA. Αυτό καθιστά δυνατή τη στόχευση συγκεκριμένων περιοχών εντός σύνθετων γονιδιωμάτων.
Οι τομείς των δακτύλων ψευδαργύρου βρίσκονται σεανθρώπινοι μεταγραφικοί παράγοντες - πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη διαδικασία σύνθεσης RNA με το πρότυπο DNA. Κατά τη δημιουργία τεχνητών νουκλεασών, είναι δυνατό να κατασκευαστεί μια αλυσίδα από «δάχτυλα ψευδάργυρου» έτσι ώστε να αναγνωρίζει ένα συγκεκριμένο τμήμα του DNA.
Εάν μια τέτοια αλυσίδα είναι αρκετά μεγάλη, τότεμπορεί να αναγνωρίσει σχετικά εκτεταμένες αλληλουχίες DNA που αποτελούνται από έναν αριθμό τρινουκλεοτιδικών θραυσμάτων. Αυτό σημαίνει πραγματική δυνατότητα στοχοθετημένης επίδρασης σε συγκεκριμένες περιοχές εντός μεγάλων πολύπλοκων γονιδιωμάτων.
Ωστόσο, αποκάλυψε και η μέθοδος «ψευδάργυρος».σοβαρά μειονεκτήματα: πρώτον, δεν πρόκειται για πολύ αυστηρή αναγνώριση των επαναλήψεων τρινουκλεοτιδίων, γεγονός που οδηγεί σε αξιοσημείωτο αριθμό διασπάσεων DNA σε περιοχές «μη-στόχους».
Δεύτερον, η μέθοδος αποδείχθηκε πολύ επίπονη καιδαπανηρή, καθώς για κάθε αλληλουχία DNA είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί η δική της βελτιστοποιημένη πρωτεϊνική δομή νουκλεασών ψευδαργύρου. Επομένως, το σύστημα "δάχτυλα ψευδαργύρου" δεν είναι ευρέως διαδεδομένο.
- ΤΑΛΕΝ
Το 2011, το περιοδικό Nature Methods ονόμασε το σύστημαTALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) "μέθοδος της χρονιάς" λόγω ενός ευρέος φάσματος πιθανών εφαρμογών σε διάφορους τομείς θεμελιώδους και εφαρμοσμένης επιστήμης.
Το TALEN είναι μία από τις μεθόδους στοχευμένης εφαρμογήςσπάστε το DNA με την επακόλουθη «επούλωση» του - για να απενεργοποιήσετε τα γονίδια σε ποντίκια. Αμέσως μετά, η τεχνολογία αυτή χρησιμοποιήθηκε για να εισαγάγει μια μετάλλαξη στο γονιδίωμα του ποντικού, οδηγώντας στην ανάπτυξη ενός από τα κληρονομικά σύνδρομα. Οι συγγραφείς της μεθόδου μοντελοποίησης γενετικά προσδιορισμένων ασθενειών κατάφεραν όχι μόνο να «χαλάσουν» το γονιδίωμα του ποντικού, αλλά και να το διορθώσουν ξανά.
- CRISPR / Cas9
Η μέθοδος παρέχει ένα ακριβές αποτέλεσμα σε συγκεκριμένες περιοχές DNA και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε σχεδόν οποιοδήποτε σύγχρονο μοριακό βιολογικό εργαστήριο.
Αυτό το σύστημα βασίζεται σε ειδικούς τομείςβακτηριακό ϋΝΑ - CRISPR (Συγκεντρωμένες τακτικά διαστήματα μεσοδιάστημα, ή σύντομες επαναλήψεις παλινδρομικών συστάδων). Αυτές οι επαναλήψεις διαχωρίζονται με διαχωριστικά - μικρά κομμάτια ξένου DNA. Τα τελευταία ενσωματώνονται στο γονιδίωμα αφού το DNA ανασυνδυάζεται με το γονιδίωμά του.
Παραδείγματα επεξεργασίας ανθρώπου
- Επεξεργασία γονιδιώματος απευθείας στο σώμα
Ασθένεια του 44χρονου κατοίκου της Αριζόνα BrianΟ Μάντο εκδηλώθηκε στην παιδική ηλικία. Είναι ανίατο και κληρονομείται κυρίως από τους άνδρες. Η βλεννοπολυσακχαρίτιδα τύπου II είναι μια μεταβολική διαταραχή: τα άτομα με αυτήν έχουν μια μετάλλαξη σε ένα γονίδιο που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή ενός ενζύμου που εμπλέκεται στη διάσπαση των σύνθετων υδατανθράκων. Ως αποτέλεσμα, συσσωρεύονται σε κύτταρα και προκαλούν πολλές παθολογίες οργάνων.
Ο άνδρας αποφάσισε να λάβει μέρος στην κλινικήδοκιμάζοντας μια νέα μέθοδο - γονιδιακή θεραπεία. Αυτή είναι μόνο η πρώτη φάση της μελέτης και πριν από την εγγραφή της θεραπείας (δηλαδή, πριν από την άδεια χρήσης αυτής της μεθόδου για όλους τους ασθενείς με σύνδρομο Hunter), πρέπει να υπάρχουν τρεις από αυτούς.
Μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε στην περίπτωση του BrianΤο Mado σάς επιτρέπει να επεξεργαστείτε το γονιδίωμα απευθείας στο ανθρώπινο σώμα - και ταυτόχρονα να στοχεύσετε με ακρίβεια ένα συγκεκριμένο τμήμα του DNA. Η επεξεργασία πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας τα λεγόμενα "ψευδαργυρωμένα δάχτυλα".
- Γενετικά τροποποιημένα παιδιά
Ο Κινέζος ερευνητής He Jiankui επεξεργάστηκε τα γονιδιώματα των ανθρώπινων εμβρύων πριν από τη γονιμοποίηση in vitro, με αποτέλεσμα δύο παιδιά με αλλοιωμένο DNA.
CRISPR / Cas9 ερευνητής συστήματοςεπεξεργάστηκε τα γονιδιώματα των επτά ζευγαριών εμβρύων κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής θεραπείας. Ως αποτέλεσμα μιας από τις εγκυμοσύνες, δύο δίδυμα κορίτσια με αλλοιωμένο DNA γεννήθηκαν από μια υγιή μητέρα και έναν πατέρα μολυσμένο με HIV. Ο Τζιανκούι εξήγησε ότι αφαίρεσε το γονίδιο CCR5 από παιδιά, το οποίο τους έδωσε δια βίου ανοσία στον HIV.
- Επιστροφή όρασης με γονιδιακή θεραπεία
Για την αποκατάσταση της όρασης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν οπτογενετικές τεχνολογίες, με τη βοήθεια των οποίων μπορεί να ελεγχθεί η εργασία των νευρώνων με τη βοήθεια ευαίσθητων στο φως πρωτεϊνών βακτηρίων και αναλαμπών λέιζερ.
Με την καθοδήγηση αυτής της ιδέας, οι βιολόγοι έχουν δημιουργήσει έναν ιόπου μπορεί να διεισδύσει στους γαγγλιονικούς νευρώνες. Αυτά τα νευρικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για τη μετάδοση σημάτων από τον αμφιβληστροειδή στον ανθρώπινο εγκέφαλο. Μόλις βρεθεί στη γαγγλιονική νεύρωση, ένας ιός τον προκαλεί να παράγει παρόμοια μόρια σηματοδότησης. Ωστόσο, αυτή η διαδικασία δεν αποκαθιστά την όραση από μόνη της, καθώς οι πρωτεΐνες των βακτηρίων αντιδρούν στο φως διαφορετικά από τις ράβδους και τους κώνους του αμφιβληστροειδούς.
Για να λύσει αυτό το πρόβλημα, ο καθηγητής της ΒασιλείαςΟ καθηγητής του Πανεπιστημίου Botond Rosca και του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ José Sahel δημιούργησαν ειδικά γυαλιά που μεταμορφώνουν την εισερχόμενη εικόνα σε μορφή κατανοητή στον εγκέφαλο και διεγείρουν τα κύτταρα γαγγλίου με λάμψεις λέιζερ. Ως αποτέλεσμα, ο ασθενής μπορεί να δει τις σιλουέτες μεγάλων αντικειμένων και αντικειμένων και να εκτελέσει άλλες πολύπλοκες ενέργειες.
Διαβάστε περισσότερα:
Οι επιστήμονες έχουν δοκιμάσει τη θεωρία της πανσπερμίας σε βαθμίδες: μπορούν να ταξιδέψουν στο διάστημα
Οι επιστήμονες διαπίστωσαν ότι ο υπερ-εμπλουτισμένος χρυσός σχηματίζεται ως γιαούρτι
Ο μικροσκοπικός κινητήρας υδρογόνου αντικαθιστά τα αντίστοιχα ορυκτά καύσιμα