El laboratorio de espectrometría de masas de Skoltech está dirigido por un miembro correspondiente de la Academia de Ciencias de Rusia
¿Qué hay en el corazón de la construcción de procesos vitales?
El ADN es una larga cadena de polímeros que almacena información sobre cómo debe verse y funcionar el cuerpo.Es decir, en qué nos diferenciamos de otras especies.y en qué se diferencian dos individuos de la misma especie. Estas moléculas determinan nuestra singularidad. Déjame darte un ejemplo: una oruga y la mariposa en la que crece. ¿Crees que sus moléculas de ADN son diferentes o iguales? De hecho, la respuesta correcta es: lo mismo. La información genética no cambia de ninguna manera durante la vida. En realidad, ¿por qué las orugas y las mariposas al final son diferentes? Porque no toda la información almacenada en el ADN se realiza al mismo tiempo. La implementación se produce mediante el proceso de transcripción, como resultado del cual, después de leer genes individuales, el ARN mensajero permite la síntesis de proteínas.
Las proteínas son máquinas moleculares universales en nuestro organismo que realizan diferentes funciones: desde la construcción hasta la reguladora.Una de las definiciones obsoletas de la vida esexistencia ordenada e interacción de moléculas de proteínas. Pero el problema es que las moléculas de proteínas también son grandes. Las proteínas también son moléculas poliméricas con un gran peso molecular: normalmente de 10 a varios cientos de kilodaltons. Y construir sobre ellos procesos vitales básicos es bastante problemático, porque son bastante sensibles a los cambios de temperatura y al entorno externo. Y probablemente esta sea la razón por la que casi todos los procesos vitales de una célula se realizan a través de moléculas pequeñas. Y la transformación de pequeñas moléculas entre sí ya está controlada por proteínas. El peso molecular de estas pequeñas moléculas oscila entre varias decenas y varios cientos de kilodaltons. Todas las pequeñas moléculas que se encuentran en un organismo vivo se denominan metabolitos.
1 dalton o 1 unidad de masa atómica (uma)- unidad de masa extrasistema utilizada para las masas de moléculas, átomos, núcleos atómicos y partículas elementales.
1 a. unidades = 1.660 539 066 60 (50) ⋅10−27 kg.
Los metabolitos primarios son sustancias químicas que se encuentran en todas las células del cuerpo y son necesarias para el mantenimiento de procesos vitales.Todas las moléculas de polímeros, proteínas yácidos nucleicos. Estos metabolitos son los mismos para todas las células de un organismo. Durante la vida, los metabolitos se transforman entre sí, por ejemplo, con el fin de transferir energía. Y estas vías de transformación (cadenas de transformación) se denominan vías metabólicas.
El ciclo de Krebs, o ciclo del ácido tricarboxílico, es responsable del proceso de respiración celular.
Se cruzan diferentes vías metabólicas en el cuerpo humano, es decir, tienen participantes comunes.Por tanto, todos los procesos que ocurren con los metabolitos están interconectados.
Los metabolitos secundarios son sustancias que no son necesarias para que todas las células aseguren sus funciones vitales.Se suelen utilizar para adaptarse a las condiciones.ambiente externo. Por ejemplo, las plantas de café producen cafeína para proteger sus hojas de las plagas. Son tóxicos para los escarabajos que comen las hojas de las plantas de café. Pero si de alguna manera eliminamos toda la cafeína de la planta, ésta seguirá viviendo. No se interrumpirán procesos vitales. El segundo ejemplo son los antibióticos. Usted sabe que la penicilina es el primer antibiótico y se aisló completamente accidentalmente del moho, lo que revolucionó la medicina. Los mohos usan penicilina para limpiar su espacio vital. Es inofensivo para el organismo original, pero tóxico para otros microorganismos. De hecho, la gente utiliza esta propiedad para tratar diversas infecciones bacterianas. Debido al hecho de que los humanos consumen activamente plantas como alimento, nuestro cuerpo está densamente poblado de diversos microorganismos que forman la microflora. Estas sustancias son metabolitos secundarios no solo de la propia persona, sino también de organismos vivos que inevitablemente ingresan a nuestro cuerpo.
El filtro natural y por qué está mal
Los xenometabolitos son antibióticos, compuestos que no están asociados con la actividad de los organismos vivos.Generalmente es algo que una persona ha recibido.artificialmente para diferentes propósitos. Por ejemplo, medicamentos, aditivos alimentarios, complementos dietéticos, dopaje, drogas, productos de combustión del tabaco, alcohol o productos de higiene, productos químicos domésticos, ecotóxicos. También se trata de moléculas pequeñas que entran en el organismo tanto de forma intencionada, en el caso de las drogas, como accidentalmente. Por ejemplo, te cepillaste los dientes, tragaste pasta de dientes y así es como entraron nuevos químicos en tu organismo. Y muchas de estas sustancias pueden tener ciertos efectos en nuestro organismo, incluso en concentraciones muy pequeñas. Además, este efecto puede ser positivo o negativo o variar según la cantidad de esta sustancia.
El hígado es la primera barrera para la entrada de sustancias químicas extrañas en la circulación sistémica.Intenta filtrar las moléculas queel cuerpo se dañará y los eliminará, impidiendo que se liberen más a través del torrente sanguíneo hacia los órganos. El hígado tiene muchos mecanismos de filtración, pero ninguno funciona al 100%: de lo contrario no habría intoxicaciones ni consecuencias graves por la ingesta de toxinas o fármacos. Sin embargo, el hígado aprovecha que nuestro cuerpo es en gran parte agua, es decir, está compuesto en un 80 por ciento de agua. Por lo tanto, el hígado intenta clasificar las moléculas en hidrofílicas, que se disuelven en agua, y en hidrofóbicas. El hígado "cree" que si la sustancia es hidrófila, entonces puede liberarse aún más a la circulación sistémica, ya que no debería causar mucho daño. Y si una sustancia es hidrófoba, entonces es necesario hacer algo con ella para evitar que se libere más o al menos hacerla más hidrófila.
El hígado tiene dos mecanismos: fases metabólicas.En la primera fase, el hígado intentaProteínas y enzimas especiales de la familia del citocromo P450 oxidan estas sustancias. Como resultado de la oxidación, la estructura de la molécula cambia y puede volverse más hidrófila. Luego, el hígado puede liberar estos metabolitos al torrente sanguíneo o intentar eliminarlos a través de los riñones a través de la orina o de los intestinos. Si esto no funciona, el hígado puede “coser” moléculas ya preparadas y solubles en agua garantizadas sobre estas moléculas oxidadas.
El metabolismo hepático aumenta la diversidad de pequeñas moléculas que pueden acabar en nuestro organismo.Por ejemplo, en la etapa de oxidación, teóricamente se forman más de 500 nuevas moléculas diferentes a partir de una molécula; no es posible predecir cuáles de ellas se forman y cuáles no.
El alfabeto infinito: por qué es tan difícil estudiar metabolitos
Los ácidos nucleicos se pueden representar como un alfabeto de cinco letras a partir del cual se construye una cadena de texto grande.Sí, por supuesto, la secuencia de letras en esteLa línea puede ser relativamente caótica, aunque durante la vida el ADN no cambia, sino que simplemente se copia. Entonces tenemos ciertas restricciones sobre cuál será esta cadena. En el caso de las proteínas, la situación es algo más complicada: ya habrá 20 letras en el alfabeto, es decir, 20 aminoácidos a partir de los cuales se construyen las proteínas, pero esto también ocurre de forma involuntaria. Por tanto, desde el punto de vista del investigador, estos objetos también son bastante similares entre sí. Y en el caso de los metabolitos, es extremadamente problemático distinguir cualquier alfabeto: de hecho, se trata de toda la tabla periódica. Y entre las reglas de formación, sólo la regla de valencia. Además, existe una característica de la química del carbono que permite que dos átomos de carbono se unan entre sí y luego se agreguen un número ilimitado de átomos de carbono u otros átomos de la tabla periódica, lo que da lugar a una enorme diversidad química de tales moléculas.
Para estudiar moléculas tan pequeñas y toda su variedad, se requieren métodos especiales.Los hay sencillos:por ejemplo, un análisis organoléptico, con el que se ha topado todo aquel que se ha hecho un análisis general de sangre o de orina y ha visto que hay una línea “olor, color” en la dirección. Cuando es necesario encontrar una molécula específica en una solución, se agrega una gota de un reactivo preseleccionado. Si había una molécula en la solución, se producirá coloración; si no, solo aparecerá un precipitado. Entre los métodos sencillos también se encuentra la espectroscopia óptica, en la que se pueden sacar conclusiones de la estructura del sedimento con la ayuda de un microscopio. Actualmente son bastante populares los métodos inmunoquímicos: esta es la misma prueba ELISA para COVID-19.
Los estudios ómicos son aquellos estudios que estudian una población completa.Y la metabolómica implica el análisis de grandesdatos que representan el conjunto completo de moléculas pequeñas en un organismo, célula u órgano. El conjunto de estos datos varía según varias estimaciones desde varios miles, si consideramos solo los metabolitos primarios, hasta varias decenas de miles, si les agregamos metabolitos secundarios de plantas, bacterias y hongos conocidos. De hecho, hasta varios cientos de millones, si tenemos en cuenta toda la diversidad química que puede entrar en el cuerpo humano. Y para estudiarlos se necesitan métodos especiales: espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas.
Durante los 80 años de historia de la RMN, los científicos involucrados en este método han recibido cinco premios Nobel.Cuatro - para RMN y el quinto - paraimagen de resonancia magnética. Un método ligeramente diferente a la espectroscopia de RMN, pero muy similar en principio. El método de RMN se basa en el hecho de que algunos átomos de la tabla periódica tienen un momento magnético distinto de cero. Son pequeños imanes y pueden interactuar con un campo magnético externo. Esta interacción se manifiesta en la división de los niveles de energía. El método de RMN permite distinguir entre diferentes átomos y átomos del mismo elemento, pero en diferentes entornos. Recientemente, la RMN ha ido perdiendo popularidad, principalmente debido a su elevado coste.
Cómo hacer partículas cargadas a partir de una mezcla compleja y averiguar su composición.
La espectrometría de masas es un método para separar partículas cargadas interactuando con un campo electromagnético.Si tomamos una mezcla compleja que consiste endiferentes partículas cargadas, y casi cualquier molécula con métodos modernos de espectrometría de masas se puede convertir en una forma cargada agregándole un protón o quitándole un protón, y aplicando un campo electromagnético a esta mezcla, entonces las partículas en este campo comenzarán para moverse y tendrán velocidad o una trayectoria dependiendo de la masa. Las partículas ligeras llegarán al detector antes que las pesadas. Después de procesar los datos del detector, se obtiene un espectro de masas, en el que a lo largo del eje Y habrá una intensidad de señal, que es proporcional al número de iones, y a lo largo del eje X, la masa en los iones, o más bien, la relación entre masa y carga. Además, la espectrometría de masas permite medir la masa con una precisión muy alta. Esto significa que es posible establecer sin ambigüedades la composición elemental del ion, las partículas cargadas o la molécula a partir de la cual se formó. Matemáticamente, esto se llama resolver la ecuación diofántica en números enteros: de hecho, se trata de una selección de coeficientes cerca de cada átomo: m(C), m(H), k(O), z(N). Y sólo una combinación de números enteros m, n, k, z puede dar la masa medida por el espectrómetro de masas.
El método de espectrometría de masas fue propuesto a principios del siglo XX por Thompson.Los científicos montaron el primer espectrómetro de masas del mundo ycon su ayuda hizo un gran descubrimiento: confirmó experimentalmente la existencia de isótopos. Por otra parte, no pudo dar una interpretación correcta de sus resultados. Su alumno William Aston hizo esto por él: en 1922 recibió el Premio Nobel por este descubrimiento. En el siglo XX, debido a una serie de guerras mundiales, la espectrometría de masas se desarrolló como método militar. Al inicio de su desarrollo encontró su principal aplicación en la industria nuclear. Dado que la espectrometría de masas puede separar sustancias en masa y determinar isótopos, puede utilizarse para separar isótopos como el uranio. Se otorgaron dos premios Nobel más por espectrometría de masas: en 1989, Wolfgang Paul y Hans Demelt, y luego, en 2002, John Fenn y Kaishi Tanaka llevaron a cabo una verdadera revolución de forma independiente. Propusieron su propio método que permite obtener una partícula cargada a partir de una gran molécula de polímero: de proteínas o de ácidos nucleicos, sin destruirla. Esto dio impulso al estudio. Actualmente, ningún laboratorio, ya sea bioquímico o de biología molecular, puede funcionar sin su propio espectrómetro de masas o sin un centro de uso compartido bien equipado en el instituto.
Habiendo determinado la masa de un ion, solo podemos determinar la composición elemental, pero no la estructura de las moléculas.Porque a una composición elemental de diferentes estructuras puede corresponder un número enorme. Es decir, los átomos de una molécula se pueden ordenar de diferentes maneras. A esto se le llama fenómeno de isomería.
Los espectrometristas de masas han ideado un método que le permite obtener un poco más de información sobre la estructura de una molécula: se coloca un cierto obstáculo en el camino de las moléculas aceleradas que vuelan.Por lo general, se trata de moléculas de gas.Cuando las moléculas chocan con estas moléculas de gas, pueden separarse por la colisión. Y luego el espectrómetro de masas mide la masa no de la molécula original, sino de los pedazos en los que se rompió. Y esta descomposición no se produce al azar, sino a lo largo de los enlaces más débiles de la molécula. Los fragmentos resultantes son idénticos y son huellas dactilares moleculares: únicas para cada molécula.
La cromatografía es un método para separar sustancias en función de su interacción con sorbentes.Los sorbentes son algo que puede absorber.otros productos químicos, y el más simple es el carbón activado, que tomamos en caso de envenenamiento. A principios del siglo XX, el científico ruso Mikhail Tsvet demostró que si se pasa un tinte tan natural a través de una columna llena de tiza, en lugar de una gran mancha manchada de verde, se obtienen varias manchas multicolores: del amarillo al verde. Así, en primer lugar, se dio cuenta de que el tinte verde de las hojas es una mezcla de diferentes sustancias. Y, en segundo lugar, descubrió la cromatografía, por la que en 1952 otros científicos que llevaron su método a una forma moderna recibieron el Premio Nobel. En la cromatografía moderna, una mezcla se pasa a través de una columna utilizando un líquido o un gas, según el tipo de cromatografía. El líquido “arrastra” las moléculas hacia adelante, hacia la salida de la columna, y el sorbente interfiere con cada molécula de diferentes maneras. Terminan abandonando la columna en distintos momentos, lo que puede ser registrado y utilizado como una huella digital más para la identificación.
Del examen del líquido cefalorraquídeo al método de sangre seca
La espectrometría de masas es el único método disponible actualmente para estudiar el líquido cefalorraquídeo.En algunos casos difíciles para el diagnóstico.enfermedades, se requiere una punción, se perfora la columna y se toma una muestra de líquido cefalorraquídeo. Pero el problema es que, en promedio, una persona tiene sólo 120 ml de líquido cefalorraquídeo. Y este líquido está bajo presión, por lo que tomar incluso 1 ml afecta significativamente esta presión y puede tener consecuencias irreversibles para el cuerpo. Por lo tanto, en realidad sólo se pueden tomar muestras de unos pocos microlitros. Ninguno de los métodos existentes, excepto la espectrometría de masas, puede manejar cantidades tan pequeñas de muestras, porque cuanto más pequeña es la muestra, menos moléculas tiene y más sensible debe ser su equipo. Para ello suele ser suficiente la sensibilidad de la espectrometría de masas. Después de la recolección, la muestra se elimina de inclusiones mecánicas y proteínas para evitar averías del equipo. Después del análisis, el resultado se procesa utilizando una computadora y se obtiene una "lista de características": el resultado es de aproximadamente 10 a 15 mil líneas. Las columnas producen una fórmula que definimos con una masa exacta, una intensidad proporcional a la cantidad de esa molécula y una "huella digital".
El método más directo para aplicar esteExperimento de espectrometría de masas de metabolómica: comparar personas enfermas y sanas para identificar qué moléculas aparecen, aparecen y cambian su concentración cuando ocurre tal diferencia.Generalmente hay dos grupos:personas sanas y personas con una enfermedad de nuestro interés, por ejemplo, con una forma específica de oncología. Para cada muestra, se obtienen dichas placas y luego los matemáticos las comparan y visualizan para encontrar diferencias entre ellas.
La primera aplicación de la espectrometría de masas es el cribado neonatal.Cada recién nacido, por orden del Ministerio de Salud con2006, se les exige realizar pruebas para detectar un determinado conjunto de enfermedades hereditarias. Ahora, en cualquier caso, en Moscú se hacen pruebas para detectar al menos 16 enfermedades diferentes. Existen este tipo de enfermedades, y a menudo se manifiestan desde los primeros minutos de vida, que, si no se detienen a tiempo, en una semana o unos días pueden dejar al niño discapacitado de por vida. Por lo tanto, dicho diagnóstico debe realizarse dentro de las primeras horas de vida del recién nacido. Los biomarcadores de casi todas estas enfermedades son metabolitos de moléculas pequeñas. Es decir, las enfermedades se manifiestan en forma de alteraciones del metabolismo, por ejemplo, la acumulación en la sangre de determinados ácidos orgánicos o determinados lípidos. Y, naturalmente, esta acumulación se produce en concentraciones muy pequeñas, de las cuales es necesario reconocer la diferencia en los cambios en el metabolismo. Por lo tanto, además de la espectrometría de masas, ningún otro método funcionará aquí.
Para resolver el problema de recolectar sangre de los niños (no es una cantidad tan grande de sangre y el miedo de los niños a los métodos invasivos y a los médicos), idearon una tecnología para analizar gotas de sangre seca.Se hace una pequeña punción y uno o másdos gotas de sangre directamente sobre un pequeño trozo de papel de filtro. El volumen de sangre aquí es de varios microlitros. Luego, esta tarjeta se seca y se envía al laboratorio, y el envío también es muy cómodo: no es necesario congelar ni descongelar la muestra. Simplemente vuelva a disolver esta tarjeta para su análisis y en unas pocas horas el análisis estará listo.
Otro campo de aplicación de la espectrometría de masas es la medicina personalizada.Todas nuestras sustancias van al hígado, y el hígadode alguna manera los metaboliza. Además, nuestro hígado funciona de manera diferente en todos nosotros, no sólo por algunas enfermedades o malos hábitos. Por ejemplo, el jugo de pomelo puede afectar significativamente su metabolismo; inhibe algunas enzimas y, como resultado, su concentración de algunos medicamentos puede ser varias veces mayor de lo esperado. Algunas personas tendrán esta concentración en la sangre después de tomar el medicamento, mientras que otras tendrán el doble de concentración. Resulta que es necesario reducir la dosis a la mitad para no causar daños innecesarios al cuerpo. De ahí la transición a la medicina personalizada. Te tomas una pastilla, te extraen sangre cada hora y miran la curva: cómo viaja la sustancia por tu cuerpo a lo largo del tiempo, cuál es su concentración en la sangre. Luego, el médico puede ajustar la dosis o incluso suspender el medicamento y recetarle otro. Y en este caso, el análisis de sangre seca también se utiliza de forma muy activa.
Cualquier nuevo fármaco que ingrese al mercado pasa necesariamente por una etapa de investigación metabólica.Algunas drogas pueden no ser muy tóxicas,pero como resultado de la descomposición en el hígado y algunos errores, estas sustancias pueden volverse aún más tóxicas. El ejemplo más sencillo es el paracetamol. Las instrucciones del paracetamol dicen que no se debe administrar a niños pequeños. Que a los niños pequeños sólo se les debe dar ibuprofeno. Y la razón de esto es la acumulación de esta molécula en el hígado, que, como resultado del metabolismo, tiene un efecto tóxico. Para un adulto con un hígado bien desarrollado, este efecto tóxico no es muy notorio, aunque, por supuesto, tampoco conviene tragar paracetamol en tarros. Para los niños pequeños, esto, de hecho, puede tener todo tipo de consecuencias desagradables e incluso irreversibles. Por lo tanto, es necesario estudiar el metabolismo de cada nuevo fármaco.
La imagen es una forma de conduciranálisis espectrométrico de masas, cuando obtenemos información no solo sobre una muestra homogénea, sino también heterogénea, y podemos estudiar su composición molecular en el espacio.Hay un ejemplo tan interesante para estudiardistribución del fármaco y sus metabolitos en el cuerpo de la rata. El experimento se lleva a cabo de la siguiente manera: a una rata se le administra un medicamento determinado, después de varias horas se sacrifica al animal y luego se corta finamente a lo largo de todo el cuerpo. Y luego una técnica especial de espectrometría de masas le permite estudiar la composición molecular de cada punto en esta muestra. Después del procesamiento por computadora, es posible visualizar dónde se han acumulado qué metabolitos. Es importante estudiar la distribución de los metabolitos, porque si está tomando un medicamento contra la neumonía, es importante que termine en los pulmones y no en el cerebro. Un bisturí espectrométrico de masas es un "cuchillo" que bombea moléculas fuera del sitio de la incisión y luego, utilizando tecnología informática, es posible determinar qué cirujano está cortando el tejido: enfermo o sano. Este método se está implementando ahora en los Estados Unidos y ya se ha realizado la primera operación real con un cuchillo de este tipo.
Huellas dactilares de cada molécula
El problema es que varios cientos o incluso miles de compuestos químicos pueden corresponder a una composición elemental.Por lo tanto es necesario identificar todas las filas.tablas, y esta es la tarea principal del análisis metabolómico moderno; desafortunadamente, no está completamente resuelta. Las huellas moleculares se comparan con las encontradas en bases de datos de moléculas químicas. Si coinciden, entonces podemos decir con cierta confianza que ésta es la molécula correcta. Pero estas bases de datos contienen un número muy limitado de sustancias. La base de datos completa de huellas dactilares contiene entre 20 y 30 mil compuestos; ni siquiera cubre todos los metabolitos primarios y secundarios que están presentes en el cuerpo humano. Hay otro problema: para reponer esta base de datos se necesita una sustancia química pura y, por lo general, son caras. Es decir, una sustancia química pura suele costar varias decenas o cientos de dólares.
Un método de identificación es crear nuevas huellas dactilares.Por ejemplo, el método ahora se está desarrollando activamente.espectrometría de movilidad iónica. Mientras que la espectrometría de masas divide los iones por masa, la movilidad de los iones permite separarlos por tamaño. Es decir, si tienes dos corredores, no uno pesado y uno liviano, sino uno grande y uno pequeño, y les pones algún tipo de obstáculo en el camino, por ejemplo, una red con celdas, entonces un atleta delgado Arrastra rápidamente a través de esta red y llega a la meta, pero uno gordo lo hará. Hasta que salga de esta red, vendrá corriendo después de un tiempo.
El segundo método es tratar de encontrar huellas dactilares que no requieran estándares limpios para su identificación.En el laboratorio proponemos utilizar el llamado intercambio de isótopos.
Por ejemplo, si miramos una molécula así, entoncesveremos que tiene átomos de hidrógeno asociados con el oxígeno. Entonces, son especiales. Pueden dejar esta molécula y regresar a ella. Si tenemos esta molécula disuelta en agua, entonces el hidrógeno puede salir de la molécula y el hidrógeno puede regresar del agua. Y si tomamos no solo agua, sino agua pesada, donde en lugar de hidrógeno hay deuterio, entonces el hidrógeno puede salir de la molécula y el deuterio puede ocupar su lugar. Se sabe que el deuterio difiere del hidrógeno en el peso molecular por unidad, y un espectrómetro de masas puede ver tal cambio. Simplemente contando el número de tales hidrógenos, se puede decir si se trata de una molécula necesaria o innecesaria, si la identificamos correctamente o no.
La inteligencia artificial se puede utilizar para identificar moléculas.Según la información disponible, puede completarbases de datos de información faltante utilizando métodos de aprendizaje profundo. Es decir, entrenamos el modelo y este predice las huellas digitales necesarias en función de la estructura de la molécula, que luego podemos usar para comparar con lo obtenido en el experimento.
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