Geenitekniikan soveltaminen tieteellisessä tutkimuksessa
- Geenin pudotus
Tutkia yhden tai toisen toimintaa
Knockoutia varten sama geeni tai sen fragmentti syntetisoidaan, modifioidaan siten, että geenituote menettää toimintansa. Tärkeimmät toteutustavat: sinkkisormi, morfolino ja TALEN.
Saadaksesi knockout-hiiret, saatuGeneettisesti muokattu konstrukti viedään alkion kantasoluihin, missä konstrukti käy läpi somaattisen rekombinaation ja korvaa normaalin geenin, ja muuttuneet solut istutetaan korvaavan äidin blastokystaan. Hedelmäperhossa Drosophila-mutaatiot aloitetaan suuressa populaatiossa, josta etsitään jälkeläisiä, joilla on haluttu mutaatio. Kasvit ja mikro-organismit kaatetaan samalla tavalla.
- Keinotekoinen ilme
Looginen lisäys pudotukseen onkeinotekoinen ilmentyminen, eli geenin lisääminen kehoon, jota sillä ei ollut ennen. Tätä geenitekniikan tekniikkaa voidaan käyttää myös geenien toiminnan tutkimiseen. Pohjimmiltaan ylimääräisten geenien tuontiprosessi on sama kuin poistamisen, mutta olemassa olevia geenejä ei korvata tai vahingoiteta.
- Geenituotteiden visualisointi
Käytetään, kun tehtävänä on opiskellageenituotteen lokalisointi. Yksi merkintämenetelmistä on korvata normaali geeni uudella, joka on fuusioitu reportterielementin kanssa, esimerkiksi vihreällä fluoresoivalla proteiinigeenillä GFP. Tätä sinisessä valossa fluoresoivaa proteiinia käytetään geneettisen muuntamisen tuotteen visualisointiin.
Vaikka tämä tekniikka on kätevä ja hyödyllinen, sen sivuvaikutuksetseuraukset voivat olla tutkittavan proteiinin toiminnan osittainen tai täydellinen menetys. Kehittyneempi, vaikkakaan ei niin kätevä menetelmä on lisätä tutkittavaan proteiiniin ei niin suuria oligopeptidejä, jotka voidaan havaita käyttämällä spesifisiä vasta-aineita.
- Ilmaisumekanismin tutkimus
Tällaisissa kokeissa tehtävänä on tutkiageeniekspression olosuhteet. Ilmentymisominaisuudet riippuvat ensisijaisesti pienestä DNA-palasta, joka sijaitsee koodaavan alueen edessä, jota kutsutaan promoottoriksi ja joka toimii transkriptiotekijöiden sitojana.
Tämä sivusto tuodaan kehoon asettamalla sen jälkeenoman reportterigeenin sijasta esimerkiksi GFP tai entsyymi, joka katalysoi helposti havaittavan reaktion. Sen lisäksi, että promoottorin toiminta tietyissä kudoksissa kerralla tai toisella tulee selvästi näkyviin, tällaiset kokeet antavat mahdollisuuden tutkia promoottorin rakennetta poistamalla tai lisäämällä siihen DNA-fragmentteja, sekä parantaa keinotekoisesti sen promoottoria. toimintoja.
Miksi ihmisen geenitekniikkaa tarvitaan?
Ihmisille sovellettuna geenitekniikka voisikäytetään perinnöllisten sairauksien hoitoon. Teknisesti on kuitenkin merkittävä ero potilaan itse hoidossa ja jälkeläisen genomin muuttamisessa.
Tehtävä muuttaa aikuisen genomiaon hieman monimutkaisempi kuin uusien geneettisesti muokattujen eläinrotujen jalostaminen, koska tässä tapauksessa on tarpeen muuttaa jo muodostuneen organismin useiden solujen genomia, ei vain yhden alkion munan. Tätä varten ehdotetaan käytettäväksi viruspartikkeleita vektorina.
Viruspartikkelit pystyvät tunkeutumaan sisäänmerkittävä prosenttiosuus aikuisen ihmisen soluista upottaen niihin perinnöllisen tietonsa; viruspartikkelien hallittu lisääntyminen kehossa on mahdollista. Samanaikaisesti sivuvaikutusten vähentämiseksi tutkijat yrittävät välttää geneettisesti muokatun DNA:n joutumista sukuelinten soluihin, jolloin vältetään vaikutukset potilaan tuleviin jälkeläisiin.
On myös syytä huomata tämän tekniikan merkittävä kritiikki tiedotusvälineissä: monet pitävät geneettisesti muunnettujen virusten kehittymistä uhkana koko ihmiskunnalle.
Geeniterapian avulla on mahdollista tulevaisuudessa muuttaa ihmisen genomia. Tällä hetkellä tehokkaat menetelmät ihmisen genomin modifioimiseksi ovat kehitysvaiheessa ja testataan kädellisillä.
Apinoiden pitkäaikainen geenitekniikkakokeet kohtasivat vakavia vaikeuksia, mutta vuonna 2009 kokeet kruunasi menestys: Nature-lehdessä ilmestyi julkaisu geenimanipuloitujen virusvektorien menestyksekkäästä käytöstä aikuisen urosapinan parantamiseksi värisokeudesta. Samana vuonna ensimmäinen geneettisesti modifioitu kädellinen (kasvatettu muunnetusta munasta) synnytti jälkeläisiä - tavallinen marmosetti (.Callithrix jacchus).
Vaikka pienessä mittakaavassa, geenitekniikka on jo tehnytkäytetään antamaan naisille, joilla on tietyntyyppinen hedelmättömyys, mahdollisuus tulla raskaaksi. Tässä käytetään terveen naisen munia. Tämän seurauksena lapsi perii genotyypin yhdeltä isältä ja kahdelta äidiltä.
Kuitenkin mahdollisuus ottaa käyttöön merkittävämpiihmisen genomin muutokset kohtaavat useita vakavia eettisiä ongelmia. Vuonna 2016 ryhmä tutkijoita Yhdysvalloissa sai hyväksynnän syöpähoitomenetelmän kliinisiin tutkimuksiin, joissa käytettiin potilaan omia immuunisoluja, jotka on muunnettu geneettisesti CRISPR / Cas9-tekniikalla.
Vuoden 2018 lopussa Kiinassa syntyi kaksi lasta,joiden genomi muutettiin keinotekoisesti (CCR5-geeni sammutettiin) alkiovaiheessa CRISPR/Cas9-menetelmällä osana vuodesta 2016 lähtien tehtyä HIV-torjuntatutkimusta. Toinen vanhemmista (isä) oli HIV-tartunnan saanut ja lapset syntyivät lausunnon mukaan terveinä.
Koska kokeilu oli luvaton (ennenSiksi kaikki tällaiset ihmisalkioilla tehdyt kokeet sallittiin vain kehityksen varhaisessa vaiheessa, jolloin koemateriaali tuhoutui, eli ilman alkion istuttamista kohtuun ja lasten syntymää), siitä vastaava tiedemies teki. eivät tarjoa todisteita hänen lausunnoistaan, jotka esitettiin kansainvälisessä genomin muokkaamista käsittelevässä konferenssissa.
Kiinan viranomaiset vahvistivat tammikuun 2019 lopussa virallisesti tämän kokeen tosiasiat. Sillä välin tiedemies kiellettiin harjoittamasta tieteellistä toimintaa ja hänet pidätettiin.
Kuinka ihmisen genomia muokataan?
- Sinkkisormien menetelmä
"Sinkkisormet" löytyvät myös koostumuksestaihmisen proteiinit. Tämän menetelmän ansiosta on mahdollista suunnitella ZFN-ketju siten, että se tunnistaa tietyn DNA-osan. Tämä mahdollistaa kohdentamisen tietyille alueille monimutkaisissa genomeissa.
Sinkkisormidomeeneja löytyyihmisen transkriptiotekijät - proteiinit, jotka säätelevät RNA-synteesiprosessia DNA-templaatin avulla. Keinotekoisia nukleaaseja luotaessa on mahdollista rakentaa "sinkkisormien" ketju siten, että se tunnistaa tietyn osan DNA:sta.
Jos tällainen ketju on tarpeeksi pitkä, sevoi tunnistaa suhteellisen pitkittyneet DNA-sekvenssit, jotka koostuvat lukuisista trinukleotidifragmenteista. Tämä tarkoittaa todellista mahdollisuutta kohdennettuun vaikutukseen tiettyihin alueisiin suurissa monimutkaisissa genomeissa.
Kuitenkin "sinkkisormi" -menetelmä paljasti myösvakavia haittoja: ensinnäkin tämä ei ole kovin tiukkaa trinukleotiditoistojen tunnustamista, mikä johtaa huomattavaan määrään DNA:n katkaisuja "ei-kohde-alueilla".
Toiseksi menetelmä osoittautui erittäin työläs jakallista, koska jokaiselle DNA-sekvenssille on välttämätöntä luoda oma optimoitu proteiinirakenne sinkki-sormen nukleaaseista. Siksi järjestelmä "sinkkisormet" ei ole laajalle levinnyt.
- TALEN
Vuonna 2011 Nature Methods -lehti nimitti järjestelmänTALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) "vuoden menetelmä" johtuu monenlaisista mahdollisista sovelluksista perustutkimuksen ja soveltavan tieteen eri alueilla.
TALEN on yksi kohdennetun levityksen menetelmistähajoaa DNA: ssa sen myöhemmällä "parantumisella" - geenien sammuttamiseksi hiirissä. Heti niiden jälkeen tätä tekniikkaa käytettiin mutaation tuomiseen hiiren genomiin, mikä johti yhden perinnöllisen oireyhtymän kehittymiseen. Geneettisesti määritettyjen sairauksien mallintamismenetelmän kirjoittajat onnistuivat paitsi "pilaamaan" hiiren genomin myös korjaamaan sen takaisin.
- CRISPR / Cas9
Menetelmä tuottaa tarkan vaikutuksen määriteltyihin DNA-alueisiin ja sitä voidaan käyttää melkein missä tahansa modernissa molekyylibiologisessa laboratoriossa.
Tämä järjestelmä perustuu erityisiin alueisiinbakteeri-DNA - CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats tai short Palindromic Cluster Repeats). Nämä toistot erotetaan välikappaleilla - lyhyillä fragmenteilla vieraasta DNA: sta. Jälkimmäiset sisällytetään genomiin sen jälkeen, kun DNA yhdistyy sen genomiin.
Esimerkkejä ihmisen muokkaamisesta
- Genomin muokkaus suoraan kehossa
Arizonassa asuvan 44-vuotiaan Brianin tautiMado ilmeni varhaislapsuudessa. Se on parantumaton ja sen perivät pääasiassa miehet. Tyypin II mukopolysakkaridoosi on metabolinen häiriö: ihmisillä, joilla on sitä, on mutaatio geenissä, joka on vastuussa monimutkaisten hiilihydraattien hajoamiseen osallistuvan entsyymin tuotannosta. Tämän seurauksena ne kertyvät soluihin ja aiheuttavat lukuisia elinpatologioita.
Mies päätti osallistua kliiniseen tutkimukseentestataan uutta menetelmää - geeniterapiaa. Tämä on vasta tutkimuksen ensimmäinen vaihe, ja ennen hoidon rekisteröintiä (eli ennen kuin lupaa käyttää tätä menetelmää kaikille Hunterin oireyhtymäpotilaille) niitä on oltava kolme.
Brianin tapauksessa käytetty menetelmäMadon avulla voit muokata genomia suoraan ihmiskehossa - ja samalla kohdistaa tarkasti tiettyyn DNA-osaan. Muokkaus tapahtuu niin kutsuttujen sinkkisormien avulla.
- Geneettisesti muunnetut lapset
Kiinalainen tutkija He Jiankui editoi ihmisalkioiden genomeja ennen in vitro -hedelmöitystä, jolloin syntyi kaksi lasta, joilla oli muuttunut DNA.
CRISPR / Cas9-järjestelmätutkijamuokannut seitsemän parin alkion genomia lisääntymishoidon aikana. Yhden raskauden seurauksena kaksi kaksoset tyttöä, joilla oli muuttunut DNA, syntyivät terveeltä äidiltä ja HIV-tartunnan saaneelta isältä. Hän Jiankui selitti poistaneensa CCR5-geenin lapsilta, mikä antoi heille elinikäisen immuniteetin HIV: ään.
- Visio palautetaan geeniterapian avulla
Näön palauttamiseksi voidaan käyttää optogeneettisiä tekniikoita, joiden avulla hermosolujen työtä voidaan hallita käyttämällä bakteerien valoherkkiä proteiineja ja lasersalkuja.
Tämän ajatuksen ohjaamana biologit ovat luoneet viruksen,jotka voivat tunkeutua ganglionisiin neuroneihin. Nämä hermosolut ovat vastuussa signaalien siirtämisestä verkkokalvosta ihmisen aivoihin. Kerran ganglionisessa neuroosissa virus aiheuttaa sen tuottamaan samanlaisia signalointimolekyylejä. Tämä menettely ei kuitenkaan palauta näkemystä itsestään, koska bakteerien proteiinit reagoivat valoon eri tavalla kuin verkkokalvon tangot ja kartiot.
Tämän ongelman ratkaisemiseksi Baselin professoriBotond Roscan yliopisto ja Pittsburghin yliopiston professori José Sahel ovat luoneet erityiset lasit, jotka muuttavat saapuvan kuvan aivoille ymmärrettävään muotoon ja stimuloivat ganglionisoluja lasersalamilla. Tämän seurauksena potilas voi nähdä suurten esineiden ja esineiden siluetit ja suorittaa muita monimutkaisia toimintoja.
Lue lisää:
Tutkijat ovat testanneet panspermian teoriaa tardigradeissa: he voivat matkustaa avaruudessa
Tutkijat ovat havainneet, että erittäin rikastettu kulta muodostuu jogurttina
Pieni vetymoottori korvaa fossiilisten polttoaineiden vastaavat