Dmitry Madera - voditelj odjela za molekularnu genetiku u BIOCAD-u, viši predavač na SPUFU, dr. sc.
2002. godine diplomirao je na Biološkom fakultetu Moskovskog državnog sveučilištasmjer genetika. Svoju disertaciju obranio je za doktorat filozofije biologije na programu za proučavanje funkcije i ekspresije gena na Sveučilištu Massachusetts, nakon čega je radio na Nacionalnom institutu za zdravstvo, proučavajući molekularne aspekte razvoja karcinoma i kako na njih utjecati. Godine 2015. vodio je laboratorij za molekularnu genetiku u BIOCAD-u i od tada se bavi razvojem proizvoda genske terapije. Autor je međunarodnog patenta koji opisuje novu nukleazu obitelji Cas9 i članaka iz područja razvoja karcinoma.
Jiankui eksperiment, onkološki rizik kod rođenih djevojčica i ciljanje mutacija
— Što mislite o eksperimentu kineskog biofizičara He Jiankuija koji je uredio genom dvaju embrija? Stručnjacizahtjevda bi rođene djevojke mogle imati mutacije. Kako to izbjeći?— Nakon proučavanja izvornog izvora (MIT istraživanje —"High-tech") i komentarom genetičara Fjodora Urnova, shvatio sam da mediji malo iskrivljuju informacije. Da, vjerojatnije je da će djevojčice imati mutacije. To se odnosi na one mutacije za koje se ne zna gdje će se točno dogoditi. Sada je teško utvrditi gdje su točno nastale nasumične mutacije kao rezultat utjecaja CRISPR/Cas9. Da biste to učinili, morate napraviti usporedbu s roditeljima djevojčica.
Formalno, ovo je točna izjava:Ciljne mutacije doista mogu postojati. I tu ne možete ništa učiniti. A moderne metode uređivanja gena to ne sprječavaju. To je zapravo problem, jer može biti opasno.
Krajem 2018. godine kineski znanstvenik He Jiankuiobjavio je da je mogao stvoriti genetski modificirane blizance s urođenim imunitetom na HIV. Rekao je da je uređivao embrije parova koji su podvrgnuti IVF-u, a jedan od sedam pokušaja bio je uspješan. Eksperiment je pokrenuo novi val rasprava o etici uplitanja u ljudski genetski kod.
Međutim, Fedor Urnov, stručnjak za uređivanjeGenom Sveučilišta u Kaliforniji, u intervjuu za MIT Technology Review, primijetio je: "Tvrdnja da je reproducirao preovlađujući CCR5 izrazito je pogrešno predstavljanje", i dodala da se ona može opisati samo kao "namjerno pogrešno predstavljanje".
Novo istraživanje s MIT-a pokazalo je da to znanstvenici nemajumogli reproducirati prevladavajuću verziju CCR5. Iako je tim usmjeren na pravi gen, istraživači nisu kopirali željenu varijantu Delta 32, već su stvorili nova izdanja, čiji učinak nije jasan - iako mogu izazvati mutacije.
Tvrdeći da He Jiankui nije mogao mutiratigen CCR5 (gen koji omogućuje HIV-u da zarazi ljudske stanice – Hi-Tech) je netočan. Zapravo je postigao svoj cilj, a CCR5 je doista mutiran i više ne radi, što znači da HIV ne može zaraziti stanice. Da, on očito nije bio u stanju reproducirati određeni prirodni alel koji se nalazi u ljudskoj populaciji, ali, unatoč tome, CCR5 je "nokautiran" i ne radi, što znači da je Jiankui postigao minimalni cilj.
Kako biste spriječili mutacije izvan cilja,potrebno je poboljšati metode uređivanja genoma, povećati njihovu točnost. Tako će u budućnosti biti moguće smanjiti rizik od mutacija na pozadinsku razinu, a zatim se smiriti zbog činjenice da se mutacije događaju prirodnim putem. Kako kažu, nije potrebno biti ljepši od Pape.
- To jest, kad te djevojke odrastu, biti će nerealno točno shvatiti koje su mutacije imale kao rezultat Jiankuijeve akcije?
- Kada govorimo konkretno o CCR5, onda, naravno,moguće je. I za cijeli genom - u principu, to je moguće i sada, ako uzmete genetski materijal njihovog oca i majke i usporedite ga s njihovim vlastitim. Tada će postati jasno koji roditelji imaju mogućnosti, a koji od onih koji su prisutni u genomu djevojčica, nemaju ni mama ni tata. Druga stvar je da će biti nemoguće otkriti koje su mutacije nastale kao rezultat CRISPR / Cas, a koje nasumično. Možete usporediti samo učestalost ovih mutacija: koliko se normalnih mutacija dogodi pri rođenju i koliko ih ima. Ako će biti više veličine, tada je sve jasno.
Tehnologija za uređivanje genoma CRISPR/Cas9 ima potencijal iskorijeniti tisuće nasljednih bolesti koje su se prije smatrale neizlječivima.
Glavna razlika između genskog alatauređivanje CRISPR / Cas9 iz drugih, dovoljno dugo postojećih metoda - to je mogućnost usmjerenih promjena DNA. CRISPR / Cas9 omogućava vam posebno utjecati na slijed DNK, pa čak i promijeniti slomljeni gen u pravi. Da biste to učinili, poseban enzim, nukleaza, uvodi jaz na pravom mjestu u genomu, nakon čega se aktivira sustav popravljanja - unutarnji mehanizmi stanice za obnavljanje genoma. U ovom se slučaju DNK popravlja na mjestu prekida, u pravilu, slučajnim pogreškama, što najvjerojatnije dovodi do gubitka ili umetanja nekoliko slova u nizu i pojave mutacija. Stoga traži uzorak za željeni niz u susjednim genima. Prema tehnologiji, stanica mora pronaći ovu sekvencu u posebnim fragmentima DNA. Njihova genetika uvedena je u stanicu kako bi je uzela i samostalno je uvela u sebe. Međutim, nasumične mutacije na mjestu rupture događaju se mnogo češće od usmjerene reparacije duž uzorka.
Još jedno pitanje, Konstantin Severinov (russpecijalist u području molekularne biologije i CRISPR/Cas - Hi-Tech) svojedobno je iznio zanimljivu ideju da, da je tamo bilo nešto potpuno strašno, djevojčice jednostavno ne bi preživjele čak ni u fazi embriogeneze. Najvjerojatnije ništa fundamentalno u vezi s njihovim genomom nije pogođeno. Jedina stvar koja me plaši je onkologija. Stvarno se nadam da neće imati slične bolesti.
- Zašto? Postaje li onkologija vjerojatnija kao posljedica uređivanja ljudskog genoma?
- Sigurno. Pogledajmo uzroke raka.Tri su: nasljedne mutacije, odnosno posebni aleli koji nose vjerojatnost povećanja rizika od raka, poput Angeline Jolie; virusni uzroci - ljudski papiloma virus, na primjer; i nasumične mutacije. Bojim se upravo pojave mutacija ovog drugog tipa kod djevojaka iz kineskog eksperimenta, pogotovo ako je tu bila velika učestalost mutacija. Tada je vjerojatnost pojave tumora bilo koje vrste različita od nule.
Dmitrij Madera. Fotografija: Science Bar Hopping
Kako urediti ljudski genom, vodeće zemlje i sudbinu ruske genetike
- Koliko je lakše provoditi takve eksperimente sa životinjama?
— Urediti genom svake životinjetreba ti vlastiti protokol. Morate urediti miša ili kravu koristeći različite protokole. I čovjek, poput druge životinje, zahtijeva njegov razvoj za sebe kako bi najučinkovitije uređivao svoj genom. Stoga se ne može reći da je teže urediti osobu nego kravu. Samo trebate to učiniti drugačije nego s mišem ili štakorom. Ali pristupi ostaju isti. Kod nas se ne razlikuje ništa.
- To jeproblem leži samo u polju etike i zakona? A da je odlučeno, hoće li biti više eksperimenata?
- Nedvojbeno.A onda, zapravo ima jako puno eksperimenata. Idem na konferencije i često se susrećem s kolegama. Na primjer, Sveučilište u Oregonu provodi izvrsne eksperimente na uređivanju ljudskog genoma i uzgoju embrija. Jednostavno se naknadno uništavaju u određenoj, ranoj fazi. Takvi eksperimenti nisu zabranjeni. Zapravo, jedino ograničenje je implantacija embrija i njegova kultivacija do rođenja.
- Koje su zemlje vodeće u istraživanju uređivanja ljudskog genoma danas?
— Sada su dva takva vođa, između njih i svihostali su apsolutni ponor. To su SAD i Kina. Nitko nije ni bliže, toliko su udaljeni od ostatka svijeta u svojim istraživanjima.
- Je li to povezano s financiranjem ili znanstvenom bazom?
- Sa oboje.Kina ulaže mnogo novca u istraživanja, njihova vlada je jako zabrinuta zbog toga. I ako su ranije jednostavno kopirali tehnologiju, sada kineski znanstvenici rade zanimljive stvari. A u SAD-u jednostavno postoji vrlo jaka znanstvena baza. Zapravo, gdje su otkriveni svi ti CRISPR/Cas? Većina pronalazača ove metode, osim Jennifer Doudna, su Kinezi, ali rade u SAD-u. Dakle, postojala je tolika sinergija između dvije zemlje.
— Što sprječava Rusiju da se razvija na ovom području? Čak i predsjednikon je naveoo prioritetu istraživanja u smjeru genetike.
- Reći ću ovo, danas već postoji financiranjeistraživanja - izdvaja se puno novca. Ali, naravno, sve se to ne napravi u jednom satu. Trebamo znanstvenu bazu i školu. U Rusiji, što se tiče genetike, sve je tužno nakon lizenkoizma. Prije Lysenka, sovjetska škola genetike bila je jedna od najboljih na svijetu. Vavilov je otišao u Morgan (Thomas Morgan - jedan od osnivača genetike, dobitnik Nobelove nagrade - "High Tech") i komunicirali su pod jednakim uvjetima. Nakon Lysenka sve je uništeno na barbarski način. I od tada se ne možemo oporaviti. Da, novac je vrlo važan. Ali također je potrebno da djeca idu na studij, kako bi se uključili strani stručnjaci. A ako postoji škola, bit će uređivanje genoma u Rusiji.
- Kako će na to utjecati nedavne preporuke u vezi s komunikacijom ruskih i stranih znanstvenika - prijaviti sve kontakte, praktično komunicirati, kao u Sovjetskom Savezu?
- Ovo je vrlo zastrašujuće. Najgore što se može učiniti za rusku znanost i ubiti je u potpunosti su ove preporuke. I razumijem da su to samo preporuke i da ih ne treba slijediti. Ali ljudi se, pak, boje. I počinju ih provoditi preventivno. Pogotovo ne znanstvenici, već birokrati iz znanosti. Oni će početi prestati komunicirati sa stranim znanstvenicima. Znam priču kad su znanstveni supružnici iz Njemačke neko vrijeme dolazili na neku konferenciju u Rusiju, a strani znanstvenici nam često ne dolaze i nisu im dozvoljeni događaji zbog tih zahtjeva. Znanost je međunarodna i trebate što više komunicirati i komunicirati s kolegama i tada će to biti dobro. Oštro osuđujem te zahtjeve.
Liječenje gluhoće, opasnih bolesti i isporuka lijekova
— ruski genetičar Denis Rebrikovide naurediti genom embrija za parove s oštećenjima sluha. Koliko je vjerojatan uspjeh takvog eksperimenta?
— Denis Vladimirovič uzeo je u obzir sve svoje pogreškeKineski kolega. Napravit će sekvenciranje cijelog genoma. A sam eksperiment odvijat će se u kontroliranijem okruženju, a ne u polupodzemnim uvjetima, kao što je bio slučaj s Jiankuijem. Mislim da je uspjeh, u načelu, s metodološke točke gledišta, moguć, a ispada da sve nije tako strašno, pogotovo kada se koriste suvremene metode. A razina mutacije može biti na razini pozadine. Što se tiče ove bolesne djece, da, radi se o monogenskoj mutaciji, i to dominantnoj, odnosno prilično ju je lako uništiti, što genetičari već dobro rade. I, zapravo, to je to, ništa ne stoji na putu dalje.
— Kako se to uklapa u ruski zakon?
- Što se tiče zakonodavnih aspekata, Rebrikovsamo djeluje na tome. U tom je smislu vrlo zanimljivo znati što se tamo događa. Zaista bih želio da on uspije probiti ovaj zakonodavni zid. Iako njegov primjer i bolest koju je odabrao, prema mišljenju mnogih mojih kolega i moji, nisu toliko relevantni. Ali teren se otvara ogromno, pa neka bude prvi i pokaže dobar rezultat. I dalje će biti moguće proširiti "repertoar".
- Koje se druge opasne bolesti mogu liječiti s CRISPR / Cas?
— Naravno, cistična fibroza je vrlo ozbiljnabolest. Moguće je koristiti editiranje gena u liječenju Duchenneove mišićne distrofije, barem kod nekih pacijenata koji imaju mutaciju više ili manje pogodnu za to. Općenito, postoji više od 10 tisuća monogenih genetskih bolesti, a ovdje se postavlja pitanje koja je metoda prikladnija i jednostavnija za liječenje. Na primjer, spinalnu mišićnu atrofiju ne treba liječiti uređivanjem, već jednostavno genskom nadomjesnom terapijom.
Cistična fibroza- sistemske nasljedne bolesti,uzrokovana mutacijom gena za transmembranski regulator cistične fibroze i karakterizirana oštećenjem egzokrinih žlijezda i teškim poremećajem funkcije dišnih organa. Cistična fibroza je od posebnog interesa ne samo zbog svoje široke raširenosti, već i zbog toga što je bila jedna od prvih nasljednih bolesti koje su se liječile. Cističnu fibrozu kao poseban entitet prvi je prepoznala Dorothy Andersen 1938. godine.
Duchenne miostrostrofija- uzrokovano brisanjem ili dupliciranjem jednogili nekoliko egzona ili točkastih mutacija u genu distrofina. Glavna manifestacija je slabost mišića, otežano kretanje od djetinjstva, koje s vremenom napreduje. Smrt obično nastupa u drugom ili trećem desetljeću života. Njegovo prosječno trajanje je 25 godina, ali ima ljudi koji žive i duže.
- Kad će znanstvenici to moći učiniti? Koji je vremenski raspon?
- Gledajte, životinje su već na liječenju.Istina, prvo “sakate”, naravno (to jest, naprave modele životinja za proučavanje bolesti), a zatim liječe. Ali sve to dolazi samo do svjesne klinike, a to, u pravilu, traje od 5 do 15 godina. I koliko sam shvatio, budući da je ovo potpuno novi pristup, prve kliničke studije će trajati jako dugo. To znači da ćemo morati čekati 15-20 godina. Tada će to izgledati ovako: dođite, odmah se dijagnosticirajte i liječite.
Dmitrij Madera. Foto: Science Bar Hopping
- To jest, ne govorimo o uređivanju genoma embrija, nego o liječenju odraslih?
— Oba će pristupa biti moguća.
- Pričajmo ouređivanje genabez dvostrukog lomljenja. Zašto znanstvenici to nisu mogli prije?
“Stvar je u tome da uopće nije lako.”Kad sam prvi put pročitao publikaciju Nature, pomislio sam: "Oh, kako se toga nisam sjetio?" Šalu na stranu, bilo je to puno posla, jer u početku je postojala slična ideja, ali kada su je znanstvenici pokušali, nisu uspjeli. Zatim su počeli mijenjati reverznu transkriptazu, u biti je mutirajući kako bi radila drugačije. I već u određenoj iteraciji je proradio i počeo proizvoditi tako nešto. Bio je to proces koji je zahtijevao puno vremena i financijskih sredstava. Stoga me ne čudi što je prošlo vrijeme između izuma jednostavnog CRISPR/Cas i pojave metode koja koristi reverznu transkriptazu. Jer nije trivijalan.
- Koje se mogućnosti otvaraju zahvaljujući ovoj novoj metodi?
- Prilike su velike, jer sadaIspada da s minimalnim rizikom pojave ciljnih mutacija možemo vrlo konkretno promijeniti bilo koji gen, alel. Na primjer, ako želimo uspostaviti točku mutacije, stvorimo brisanje ili složenu zamjenu. To nam daje velike mogućnosti, jer obično su jedna ili dvije mutacije ili delecije koje nastaju malene i mogu se obnoviti unutar 40-50 nukleotida.
U stvari, postojale su tehnologije malo ranije -nukleotidni urednici koji su jednostavno uzeli i zamijenili, na primjer, "A" s "G" ili "C" s "T". Takvi su radovi bili i još uvijek se koriste, ali, naravno, tamo sve nije jednostavno, jer ispada da oni uređuju ne samo DNK, već i RNK, i ne kažu da su vrlo precizni - ne uređuju točno jedan nukleotid i cijeli "prozor". Možda će se to kasnije pretvoriti u praktičnu upotrebu. Ali do sada postoje mnogi problemi. Sjetio sam se ove metode jer ona također ne uključuje dvostruke pauze. I nastala je malo ranije od ovih nedavnih studija.
— Inženjeri sa sveučilišta MIT i HarvardkoristiCRISPR za stvaranje sustava za isporuku lijekova koji ih oslobađa samo u određenom trenutku. Kako se to točno događa?
- Kada govorimo konkretno o ovoj metodi, onda tosuština je u tome što je DNK polimer, a Cas12a ga siječe, uništavajući na taj način polimernu strukturu. Ako je DNK ugrađena u hidrogel, tada se iz nje oslobađaju tvari koje su prethodno fiksirane u hidrogelu s lancima DNK. Odnosno, ovdje DNK djeluje jednostavno kao fizički materijal koji se može razgraditi na kontrolirani način. Općenito, hidrogeli se koriste na ranama i drugim ozljedama kada je potrebno postupno otpuštanje lijekova iz njih.
U principu, CRISPR/Cas bi mogao nešto isporučitipotrebno za položaj u genomu. To je sve što može. Ali ne može dostaviti lijek u stanicu. Stoga nije sasvim ispravno govoriti o njegovoj upotrebi za isporuku lijekova.
Ali dostaviti CRISPR / Cas kaolijekovi u stanicu; potrebne su metode isporuke. A oni postoje - mogu biti virusni i nevirusni. Virusi su se, naravno, razvijali kroz cijelu povijest kako bi se stanica dostavljala određeni genetski materijal. Oni se množe tako. A nevirusne metode su jednostavno kemijske metode, kad se stvore neki nosači koji u sebi sadrže molekule nukleinske kiseline, a ne nužno i DNK, može biti čak i RNA ili protein. Obično su to kapljice masti koje štite ono što moraju osigurati od nukleusa i proteaza, a na njih se mogu objesiti i antitijela kako bi im se donijela specifičnost za određenu stanicu. A ti lipofilni kompleksi dostavljaju lijekove u stanicu. A tu su djela povezana sa složenim polimerima ili zlatnim nanočesticama, koje poput topa, razmrdavaju ćelije, upadaju u njih i dostavljaju svoj sadržaj, poput genomskog topa.
- Je li moguće značajno produžiti život osobe zahvaljujući uređivanju gena? Koliko se to može učiniti i koje bolesti treba izliječiti na ovaj način?
- Složeno pitanje.Činjenica je da postoje mutacije koje kod životinja uzrokuju određeno produljenje života, usporavanje starenja. Obično su povezani sa sustavom popravka DNK. Na mnogo načina, starenje je posljedica nakupljanja slučajnih pogrešaka koje dovode do aktivacije retrovirusnih elemenata, a kao rezultat toga genom nije reguliran i počinje raditi protiv svog domaćina. Ovdje postoji poanta, ne znamo kako će to djelovati kod ljudi. Nažalost, i to je bilo veliko iznenađenje, mehanizmi starenja i zaštite od starenja vrlo su specifični za vrstu. A za ljude se isti miševi nisu pokazali posve odgovarajućim modelom. A što je model adekvatniji i što duže živi, to je s njim teže raditi. Na primjer, isti SIRT6 - kod dugovječnih vrsta je jedan, a kod kratkoživućih je drugačiji, postoji jasna korelacija. Činilo se da uzmite i umetnite SIRT6 od slona do osobe. Ili nekoliko kopija ljudskog SIRT6 (gen koji kodira protein sirtuin-6 pomaže u ispravljanju oštećenja DNK - prekidi dvostrukih lanaca i supstitucije u genetskim nukleotidnim slovima - Hi-Tech). Ovo može raditi, a možda i ne. Postoji takva mogućnost i naravno da bih pokušao. Ali ako govorimo o produljenju života, onda najvjerojatnije trebamo urediti gene povezane s popravkom DNK. Danas je, pak, za takav organizam kao što je čovjek to samo hipoteza.