Skoltechov laboratorij za spektrometriju mase vodi dopisni član Ruske akademije znanosti
Što leži u srži izgradnje životnih procesa
DNA je dugački polimerni lanac koji pohranjuje informacije o tome kako tijelo treba izgledati i funkcionirati.Odnosno, po čemu se razlikujemo od drugih vrstate kako se dvije jedinke iste vrste razlikuju jedna od druge. Ove molekule određuju našu jedinstvenost. Dat ću vam primjer: gusjenica i leptir u kojeg ona izrasta. Mislite li da su njihove molekule DNK različite ili iste? Zapravo, točan odgovor je: isto. Genetske informacije se ni na koji način ne mijenjaju tijekom života. Zapravo, zašto su gusjenice i leptiri na kraju različiti? Zato što se sve informacije pohranjene u DNK ne realiziraju u isto vrijeme. Implementacija se odvija kroz proces transkripcije, uslijed čega, nakon čitanja pojedinih gena, glasnička RNA omogućuje sintezu proteina.
Proteini su univerzalni molekularni strojevi u našem tijelu koji obavljaju različite funkcije: od konstrukcije do regulacije.Jedna od zastarjelih definicija života jeuređeno postojanje i međudjelovanje proteinskih molekula. Ali problem je u tome što su molekule proteina također velike. Proteini su također polimerne molekule velike molekularne težine: obično od 10 do nekoliko stotina kilodaltona. A izgradnja osnovnih životnih procesa na njima prilično je problematična, jer su prilično osjetljivi na promjene temperature i vanjskog okruženja. I to je vjerojatno razlog zašto se gotovo svi vitalni procesi u stanici ostvaruju preko malih molekula. A transformaciju malih molekula jedne u drugu već kontroliraju proteini. Molekulska težina ovih malih molekula je od nekoliko desetaka do nekoliko stotina kilodaltona. Sve male molekule koje se nalaze u živom organizmu nazivaju se metaboliti.
1 dalton ili 1 atomska jedinica mase (amu)- izvansustavna jedinica mase koja se upotrebljava za mase molekula, atoma, atomskih jezgri i elementarnih čestica.
1 a. jedinice = 1.660 539 066 60 (50) ⋅10−27 kg.
Primarni metaboliti su kemikalije koje se nalaze u svim tjelesnim stanicama i neophodne su za održavanje vitalnih procesa.Sve polimerne molekule, proteini inukleinske kiseline. Ovi metaboliti su isti za sve stanice jednog organizma. Tijekom života metaboliti se pretvaraju jedni u druge, npr. u svrhu prijenosa energije. A ti putovi transformacije - lanci transformacije - nazivaju se metabolički putovi.
Krebsov ciklus ili ciklus trikarboksilne kiseline odgovoran je za proces staničnog disanja.
Različiti se metabolički putovi u ljudskom tijelu presijecaju, odnosno imaju zajedničke sudionike.Dakle, svi procesi koji se javljaju s metabolitima međusobno su povezani.
Sekundarni metaboliti su tvari koje nisu potrebne svim stanicama kako bi osigurale svoje vitalne funkcije.Obično se koriste za prilagodbu uvjetimavanjsko okruženje. Na primjer, biljke kave proizvode kofein kako bi zaštitile svoje lišće od štetnika. Otrovni su za kornjaše koji jedu lišće biljaka kave. Ali ako na neki način uklonimo sav kofein iz biljke, ona će nastaviti živjeti. Nikakvi vitalni procesi neće biti poremećeni. Drugi primjer su antibiotici. Znate da je penicilin prvi antibiotik, a potpuno je slučajno izoliran iz plijesni, što je revolucioniralo medicinu. Plijesni koriste penicilin za čišćenje svog životnog prostora. Bezopasan je za roditeljski organizam, ali otrovan za druge mikroorganizme. Zapravo, ljudi koriste ovo svojstvo za liječenje raznih bakterijskih infekcija. Zbog činjenice da ljudi aktivno konzumiraju biljke kao hranu, naše tijelo je gusto naseljeno raznim mikroorganizmima koji tvore mikrofloru. Ove tvari su sekundarni metaboliti ne samo same osobe, već i živih organizama koji neizbježno ulaze u naše tijelo.
Prirodni filtar i zašto nije u redu
Ksenometaboliti su antibiotici, spojevi koji nisu povezani s aktivnošću živih organizama.Obično je to nešto što je osoba primilaumjetno za različite svrhe. Na primjer, lijekovi, dodaci prehrani, dodaci prehrani, doping, lijekovi, proizvodi izgaranja duhana, alkohol ili higijenski proizvodi, kemikalije za kućanstvo, ekotoksična sredstva. I to su male molekule, au tijelo ulaze i namjerno, u slučaju lijekova, i slučajno. Na primjer, oprali ste zube, progutali pastu za zube - i tako su nove kemikalije došle u vaš sustav. A mnoge od tih tvari mogu imati određene učinke na naše tijelo, čak iu vrlo malim koncentracijama. Štoviše, ovaj učinak može biti pozitivan ili negativan ili varirati ovisno o količini ove tvari.
Jetra je prva prepreka ulasku stranih kemikalija u sustavnu cirkulaciju.Pokušava filtrirati molekule kojetijelo će biti oštećeno i ukloniti ih, sprječavajući njihovo daljnje oslobađanje kroz krvotok u organe. Jetra ima mnogo mehanizama filtracije, ali nijedan od njih ne radi 100%: inače ne bi bilo trovanja i ozbiljnih posljedica uzimanja bilo kakvih otrova ili lijekova. Međutim, jetra iskorištava činjenicu da je naše tijelo velikim dijelom vodeno, odnosno da se sastoji od 80 posto vode. Stoga jetra pokušava razvrstati molekule na hidrofilne, koje se otapaju u vodi, i hidrofobne. Jetra "vjeruje" da ako je tvar hidrofilna, onda se može dalje otpuštati u sustavnu cirkulaciju, jer ne bi trebala uzrokovati veliku štetu. A ako je tvar hidrofobna, onda s njom treba nešto učiniti kako bi se spriječilo daljnje otpuštanje ili barem učinila hidrofilnijom.
Jetra ima dva mehanizma – metaboličke faze.U prvoj fazi jetra pokušavaposebni proteini i enzimi obitelji citokroma P450 oksidiraju te tvari. Kao rezultat oksidacije mijenja se struktura molekule i ona može postati hidrofilnija. Jetra zatim može otpustiti te metabolite u krvotok ili ih pokušati ukloniti kroz bubrege u urinu ili kroz crijeva. Ako to ne uspije, jetra može na te oksidirane molekule "prišiti" već gotove, zajamčeno topljive molekule u vodi.
Jetreni metabolizam povećava raznolikost malih molekula koje mogu završiti u našim tijelima.Primjerice, u fazi oksidacije teoretski se od jedne molekule formira više od 500 različitih novih novih molekula; nije moguće predvidjeti koje su od njih nastale, a koje ne.
Beskonačna abeceda: zašto je tako teško proučavati metabolike
Nukleinske kiseline mogu se predstaviti kao abeceda od pet slova od koje je izgrađen veliki tekstualni niz.Da, naravno, redoslijed slova u ovomelinija može biti relativno kaotična, iako se tijekom života DNK ne mijenja, već se jednostavno kopira. Dakle, imamo određena ograničenja o tome što će ovaj niz biti. Kod proteina je situacija nešto kompliciranija: u abecedi će već biti 20 slova, odnosno 20 aminokiselina od kojih su građeni proteini, ali i to se događa nehotično. Stoga su, s točke gledišta istraživača, ovi objekti vrlo slični jedni drugima. A u slučaju metabolita, izuzetno je problematično izdvojiti bilo koju abecedu: zapravo, ovo je cijeli periodni sustav. A među pravilima tvorbe – samo pravilo valencije. Osim toga, postoji značajka kemije ugljika koja omogućuje da se dva atoma ugljika povežu jedan s drugim, a zatim naknadno dodaju neograničen broj atoma ugljika ili drugih atoma iz periodnog sustava, što dovodi do ogromne kemijske raznolikosti takvih molekula.
Za proučavanje tako malih molekula i sve njihove raznolikosti potrebne su posebne metode.Postoje jednostavni:na primjer, organoleptička analiza, s kojom se susreo svatko tko je uzeo opći test krvi ili urina i vidio da u smjeru postoji linija "miris, boja". Kada je potrebno pronaći određenu molekulu u otopini, dodaje se kap unaprijed odabranog reagensa. Ako je u otopini bilo molekule, doći će do bojanja; ako nije, pojavit će se samo talog. Među jednostavnim metodama postoji i optička spektroskopija, kada pomoću mikroskopa možete izvući zaključke iz strukture sedimenta. Sada su vrlo popularne imunokemijske metode: ovo je isti ELISA test za COVID-19.
Omične studije su one studije koje proučavaju kompletnu populaciju.A metabolomika podrazumijeva analizu velikihpodaci koji predstavljaju cjelovit skup malih molekula u organizmu, stanici ili organu. Skup tih podataka varira prema različitim procjenama od nekoliko tisuća, ako uzmemo u obzir samo primarne metabolite, do nekoliko desetaka tisuća ako im dodamo sekundarne metabolite poznatih biljaka, bakterija i gljivica. Zapravo i do nekoliko stotina milijuna, ako uzmemo u obzir svu kemijsku raznolikost koja može ući u ljudsko tijelo. A za njihovo proučavanje potrebne su posebne metode: spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije (NMR) i masena spektrometrija.
Tijekom 80-godišnje povijesti NMR, znanstvenici uključeni u ovu metodu dobili su pet Nobelovih nagrada.Četiri - za NMR, a peti - zamagnetska rezonanca. Metoda malo drugačija od NMR spektroskopije, ali vrlo slična u načelu. NMR metoda temelji se na činjenici da neki atomi u periodnom sustavu imaju magnetski moment različit od nule. Oni su mali magneti i mogu komunicirati s vanjskim magnetskim poljem. Ta se interakcija očituje u cijepanju energetskih razina. NMR metoda omogućuje razlikovanje različitih atoma i atoma istog elementa, ali u različitim okruženjima. U posljednje vrijeme NMR gubi na popularnosti, prvenstveno zbog visoke cijene.
Kako napraviti nabijene čestice od složene smjese i saznati njihov sastav
Masena spektrometrija metoda je odvajanja nabijenih čestica interakcijom s elektromagnetskim poljem.Ako uzmemo neku složenu smjesu koja se sastoji odrazličite nabijene čestice, a gotovo svaka molekula s modernim metodama masene spektrometrije može se pretvoriti u nabijeni oblik dodavanjem protona ili uklanjanjem protona iz nje, i primjenom elektromagnetskog polja na tu smjesu, tada će čestice u tom polju početi kretati se i imat će ili brzinu ili putanju ovisno o masi. Lagane će čestice prije stići do detektora od teških. Nakon obrade podataka iz detektora dobiva se maseni spektar u kojem će duž Y osi biti intenzitet signala, koji je proporcionalan broju iona, a duž X osi - masa u ionima, odnosno, omjer mase i naboja. Štoviše, masena spektrometrija omogućuje vam mjerenje mase s vrlo visokom točnošću. To znači da je moguće nedvosmisleno utvrditi elementarni sastav iona, nabijene čestice ili molekule iz koje je nastao. Matematički, to se zove rješavanje Diofantove jednadžbe u cijelim brojevima: zapravo, ovo je izbor koeficijenata u blizini svakog atoma: m(C), m(H), k(O), z(N). A samo jedna kombinacija cijelih brojeva m, n, k, z može dati masu izmjerenu spektrometrom mase.
Metodu masene spektrometrije predložio je početkom dvadesetog stoljeća Thompson.Znanstvenici su sastavili prvi maseni spektrometar na svijetu iuz njegovu je pomoć došao do velikog otkrića: eksperimentalno je potvrdio postojanje izotopa. S druge strane, nije mogao dati točnu interpretaciju svojih rezultata. Za njega je to učinio njegov učenik William Aston: 1922. za to je otkriće dobio Nobelovu nagradu. U 20. stoljeću, zbog niza svjetskih ratova, masena spektrometrija se razvila kao metoda za vojsku. Na početku svog razvoja glavnu primjenu našao je u nuklearnoj industriji. Budući da spektrometrija mase može razdvojiti tvari po masi i odrediti izotope, može se koristiti za odvajanje izotopa kao što je uran. Za masenu spektrometriju dodijeljene su još dvije Nobelove nagrade: 1989. godine - Wolfgang Paul i Hans Demelt, a potom su 2002. godine - pravu revoluciju samostalno izveli John Fenn i Kaishi Tanaka. Predložili su vlastitu metodu koja omogućuje dobivanje nabijene čestice iz velike molekule polimera: iz proteina ili iz nukleinskih kiselina, a da se ne uništi. To je dalo poticaj studiju. Sada niti jedan laboratorij - biokemijski ili laboratorij za molekularnu biologiju - ne može raditi bez vlastitog masenog spektrometra ili bez dobro opremljenog zajedničkog centra na institutu.
Utvrdivši masu iona, možemo odrediti samo elementarni sastav, ali ne i strukturu molekula.Jer jednom elementarnom sastavu različitih struktura može odgovarati ogroman broj. To jest, atomi u molekuli mogu biti raspoređeni na različite načine. To se zove fenomen izomerije.
Maseni spektrometri osmislili su metodu koja vam omogućuje da dobijete malo više informacija o strukturi molekule: određena prepreka postavljena je na putu letećih ubrzanih molekula.Obično su to molekule plina.Kada se molekule sudare s ovim molekulama plina, mogu se raspasti od sudara. A onda maseni spektrometar ne mjeri masu originalne molekule, već dijelova na koje se raspala. I to raspadanje se ne događa nasumično, već duž najslabijih veza u molekuli. Dobiveni fragmenti su identični i molekularni su otisci: jedinstveni za svaku molekulu.
Kromatografija je metoda razdvajanja tvari koja se temelji na njihovoj interakciji sa sorbentima.Sorbenti su nešto što može apsorbiratidruge kemikalije, a najjednostavniji je aktivni ugljen koji uzimamo kod trovanja. Početkom dvadesetog stoljeća ruski znanstvenik Mikhail Tsvet pokazao je da ako se takva prirodna boja provuče kroz stupac napunjen kredom, tada će se umjesto jedne velike zelene razmazane mrlje dobiti nekoliko raznobojnih mrlja: od žute do zelena. Tako je, prvo, shvatio da je zelena boja iz lišća mješavina različitih tvari. I, drugo, otkrio je kromatografiju, za što su 1952. drugi znanstvenici koji su njegovu metodu doveli do nekog modernog oblika dobili Nobelovu nagradu. U modernoj kromatografiji smjesa se propušta kroz kolonu pomoću tekućine ili plina, ovisno o vrsti kromatografije. Tekućina “vuče” molekule naprijed, prema izlazu iz kolone, a sorbent na različite načine interferira sa svakom molekulom. Na kraju napuštaju kolonu u različito vrijeme, što se može snimiti i koristiti kao još jedan otisak prsta za identifikaciju.
Od pregleda cerebrospinalne tekućine do metode suhe krvi
Masena spektrometrija jedina je trenutno dostupna metoda za proučavanje likvora. В некоторых сложных случаях для диагностики заболеваний требуется пункция, прокалывается позвоночник и отбирается образец спинномозговой жидкости. Но проблема в том, что спинномозговой жидкости у человека в среднем всего 120 мл. И жидкость эта находится под давлением, поэтому отбор даже 1 мл существенно влияет на это давление и может привести к необратимым последствиям для организма. Поэтому отобрать на самом деле можно только несколько микролитров. Ни один из существующих методов, кроме масс-спектрометрии, не может работать с такими маленькими количествами образцов, потому что чем меньше образец, тем меньше у него молекул и тем чувствительнее должно быть ваше оборудование. Чувствительности масс-спектрометрии обычно для этого хватает. После забора образец избавляют от механических включений и белков, чтобы избежать поломок приборов. После анализа результат обрабатывают с помощью компьютера и получают «список признаков»: на выходе это примерно 10–15 тыс. строчек. В столбцах получается формула, которую мы определяем с точной массой, интенсивность, которая пропорциональна количеству этой молекулы, и «отпечатки пальцев».
Наиболее прямой метод применения такого метаболомного масс-спектрометрического эксперимента — сравнение больных и здоровых людей для выявления того, какие молекулы проявляются, появляются и меняют свою концентрацию при возникновении такого различия. Обычно берут две группы: людей здоровых и людей с заболеванием нас интересующим, например, с какой-то конкретной формой онкологии. Для каждого образца получают такие таблички, а дальше математики сравнивают и визуализируют их, чтобы найти между ними отличия.
Prva primjena masene spektrometrije je u neonatalnom probiranju. Каждого новорожденного, по приказу Минздрава с 2006 года, обязательно тестируют на некий набор наследственных заболеваний. Сейчас, во всяком случае, в Москве тестируют как минимум на 16 разных болезней. Есть такие заболевания, и они часто проявляются прямо с первых минут жизни, которые если вовремя не купировать, через неделю или несколько дней могут сделать ребенка инвалидом на всю жизнь. Поэтому такую диагностику необходимо производить в течение нескольких первых часов жизни новорожденного. Биомаркерами практически всех этих заболеваний являются малые молекулы-метаболиты. То есть болезни проявляются в виде сбоев в метаболизме, например, накоплении определенных органических кислот в крови или некоторых липидов. И, естественно, это накопление происходит в очень небольших концентрациях, по ним необходимо распознать разницу в изменении метаболизма. Поэтому, кроме масс-спектрометрии, здесь никакой другой метод работать не будет.
Чтобы решить проблему с забором крови у детей (не такое большое количество крови и страх детей перед инвазивными методами и врачами), придумали технологию анализа сухих пятен крови. Делается маленький прокол, и отбирается одна или две капли крови прямо на небольшой кусочек фильтровальной бумаги. Объем крови здесь — несколько микролитров. Потом эта карточка высушивается и отправляется в лабораторию, причем отправка происходит тоже очень удобно: образец не надо ни замораживать, ни размораживать. Просто перерастворить эту карточку, и на анализ, и в течение нескольких часов анализ готов.
Sljedeće područje primjene masene spektrometrije je personalizirana medicina. У нас все вещества попадают в печень, и печень их как-то метаболизирует. Причем печень у всех у нас работает по-разному не только из-за каких-то заболеваний или вредных привычек. Например, на метаболизм может существенно повлиять грейпфрутовый сок, он ингибирует некоторые ферменты и в результате концентрация некоторых лекарств у вас может оказаться в несколько раз выше ожидаемого. У некоторых людей после приема препарата концентрация в крови будет такая, а у других — в два раза выше. Получается, что дозировку нужно уменьшать в два раза, чтобы не наносить лишнего вреда организму. Отсюда и переход к персонализированной медицине. Вы пьете таблетку, у вас отбирают кровь каждый час и смотрят кривую: как у вас вещество путешествует с течением времени по организму, какая у него концентрация в крови. Дальше врач может дозировку скорректировать или вообще отменить вам препарат и назначить другой. И вот в этом случае тоже очень активно применяется анализ сухой крови.
Любое новое лекарство, выходящее на рынок, обязательно проходит стадию исследований метаболизма. Некоторые лекарства могут быть не очень токсичны, но в итоге распада в печени и некоторым ошибкам эти вещества могут превращаться даже в более токсичные. Самый простой пример — это парацетамол. В инструкции к парацетамолу сказано, что его запрещено давать маленьким детям. Что маленьким детям нужно давать только ибупрофен. А причина тому — накопление вот этой молекулы в печени, в результате метаболизма которая обладает токсическим эффектом. Для взрослого человека с его хорошо развитой печенью этот токсический эффект он не сильно заметен, хотя, конечно, глотать парацетамол банками тоже нельзя. То для маленьких детей это, на самом деле, может привести ко всяким неприятным и даже необратимым последствиям. Поэтому каждое новое лекарство обязательно изучается на метаболизм.
Имаджинг — это способ проведения масс-спектрометрического анализа, когда мы получаем информацию не только о гомогенном, но и о гетерогенном образце, причем мы можем изучить его молекулярный состав в пространстве. Postoji tako zanimljiv primjer za proučavanjeraspodjela lijeka i njegovih metabolita u tijelu štakora. Pokus se izvodi na sljedeći način: štakor dobiva određeni lijek, nakon nekoliko sati životinja se eutanazira, a zatim se životinja fino reže duž cijelog tijela. A onda vam posebna tehnika masene spektrometrije omogućuje proučavanje molekularnog sastava svake točke u ovom uzorku. Nakon računalne obrade moguće je predočiti gdje su se koji metaboliti nakupili. Važno je proučiti raspodjelu metabolita, jer ako uzimate lijek protiv upale pluća, važno je da završi u plućima, a ne u mozgu. Maseni spektrometrijski skalpel je "nož" koji ispumpava molekule s mjesta reza, a zatim je pomoću računalne tehnologije moguće utvrditi koji kirurg reže tkivo: bolesno ili zdravo. Ova se metoda sada provodi u Sjedinjenim Državama, a prva prava operacija s takvim nožem već je izvedena.
Otisci prstiju za svaku molekulu
Problem je u tome što nekoliko stotina ili čak tisuća kemijskih spojeva može odgovarati jednom elementarnom sastavu. Поэтому необходимо идентифицировать все строки таблицы, и это основная задача современного метаболомного анализа, она, к сожалению, до конца не решена. Молекулярные отпечатки сравниваются с теми, которые есть в базах данных химических молекул. Если они совпадают, значит, мы можем с некоторой уверенностью говорить, что это нужная молекула. Но в таких базах данных очень ограниченное количество веществ. Полная база отпечатков содержит в себе около 20–30 тысяч соединений, она даже не покрывает все первичные и вторичные метаболиты, которые есть в организме человека. Есть еще одна проблема: чтобы эту базу данных пополнить, нужно чистое химическое вещество, а они обычно дорогие. То есть одно химическое вещество чистое стоит обычно несколько десятков или сотен долларов.
Один из подходов к идентификации — это создание новых «отпечатков пальцев». Например, сейчас очень активно развивается метод спектрометрии ионной подвижности. Если масс-спектрометрия делит ионы по массе, то ионная подвижность позволяет разделить их по размеру. То есть если у вас есть два бегуна — не тяжелый и легкий, а крупный и мелкий, и на их пути поставить какое-то препятствие — например, сетку с ячейками, то стройный атлет быстро через эту сетку пролезет и до финиша добежит, а полный пока выпутается из этой сети, прибежит через какое-то время.
Druga metoda je pokušaj pronalaska otisaka prstiju koji ne zahtijevaju čiste standarde za prepoznavanje. Мы в лаборатории предлагаем использовать так называемый изотопный обмен.
Na primjer, ako promatramo takvu molekulu, ondavidjet ćemo da ima atome vodika povezane s kisikom. Dakle, oni su posebni. Oni mogu napustiti ovu molekulu i vratiti joj se. Ako imamo ovu molekulu otopljenu u vodi, tada vodik može napustiti molekulu, a vodik se može vratiti iz vode. A ako uzmemo ne samo vodu, već i tešku vodu, gdje umjesto vodika postoji deuterij, tada vodik može napustiti molekulu, a deuterij može zauzeti njegovo mjesto. Poznato je da se deuterij razlikuje od vodika u molekularnoj težini po jedinici, a maseni spektrometar može vidjeti takav pomak. Jednostavno brojanjem broja takvih vodika može se reći je li ovo potrebna ili nepotrebna molekula, jesmo li je točno identificirali ili ne.
Umjetna inteligencija može se koristiti za identifikaciju molekula. На основе имеющейся информации можно достроить базы данных недостающей информацией с помощью методов глубинного обучения. То есть мы обучаем модель, и она по структуре молекулы предсказывает необходимые отпечатки, которые дальше мы можем использовать для сравнения с тем, что получено в эксперименте.
Pogledajte i:
Uran je dobio status najčudnijeg planeta u Sunčevom sustavu. Zašto?
Ljudi mogu podnijeti vrlo niske temperature čak i bez izvora topline
Fizičari su stvorili analog crne rupe i potvrdili Hawkingovu teoriju. Kamo vodi?