Applicazione dell'ingegneria genetica nella ricerca scientifica
- Gene knockout
Studiare la funzione dell'uno o dell'altro
Per il knockout, lo stesso gene o un suo frammento viene sintetizzato, modificato in modo che il prodotto genetico perda la sua funzione. Principali metodi di implementazione: zinc finger, morfolino e TALEN.
Per ottenere topi knockout, il ottenutoIl costrutto geneticamente modificato viene introdotto nelle cellule staminali embrionali, dove il costrutto subisce la ricombinazione somatica e sostituisce il gene normale, e le cellule alterate vengono impiantate nella blastocisti della madre surrogata. Nella mosca della frutta, le mutazioni di Drosophila vengono avviate in una vasta popolazione, in cui vengono quindi ricercati i discendenti con la mutazione desiderata. Piante e microrganismi vengono eliminati in modo simile.
- Espressione artificiale
Un'aggiunta logica al knockout èespressione artificiale, cioè l'aggiunta di un gene al corpo che prima non aveva. Questa tecnica di ingegneria genetica può essere utilizzata anche per studiare la funzione dei geni. In sostanza, il processo di introduzione di geni aggiuntivi è lo stesso del knockout, ma i geni esistenti non vengono sostituiti o danneggiati.
- Visualizzazione del prodotto genico
Utilizzato quando il compito è studiarelocalizzazione del prodotto genico. Uno dei metodi di marcatura consiste nel sostituire il gene normale con uno fuso con un elemento reporter, ad esempio con il gene della proteina fluorescente verde GFP. Questa proteina, che emette fluorescenza alla luce blu, viene utilizzata per visualizzare il prodotto della modificazione genetica.
Sebbene questa tecnica sia comoda e utile, i suoi effetti collateralile conseguenze possono essere una perdita parziale o completa della funzione della proteina in studio. Un metodo più sofisticato, anche se non così conveniente, consiste nell'aggiungere alla proteina in esame oligopeptidi non così grandi che possono essere rilevati utilizzando anticorpi specifici.
- Indagine sul meccanismo di espressione
In tali esperimenti, il compito è studiarecondizioni di espressione genica. Le caratteristiche di espressione dipendono principalmente da un piccolo frammento di DNA situato davanti alla regione codificante, chiamato promotore, che serve a legare i fattori di trascrizione.
Questo sito viene introdotto nel corpo posizionandolo dopoinvece del proprio gene reporter, ad esempio, GFP o un enzima che catalizza una reazione facilmente rilevabile. Oltre al fatto che il funzionamento del promotore in alcuni tessuti in un momento o in un altro diventa chiaramente visibile, tali esperimenti consentono di indagare la struttura del promotore rimuovendo o aggiungendo frammenti di DNA ad esso, nonché potenziando artificialmente le sue funzioni .
Perché è necessaria l'ingegneria genetica umana?
Se applicata agli esseri umani, l'ingegneria genetica potrebbeusato per trattare malattie ereditarie. Tuttavia, tecnicamente, c'è una differenza significativa tra il trattamento del paziente stesso e la modifica del genoma della sua prole.
Il compito di modificare il genoma adultoè un po 'più complicato che allevare nuove razze di animali geneticamente modificate, poiché in questo caso è necessario modificare il genoma di numerose cellule di un organismo già formato, e non solo di un ovulo embrionale. Per fare ciò, si propone di utilizzare particelle virali come vettore.
Le particelle virali sono in grado di penetrareuna percentuale significativa di cellule adulte, incorporando in esse le proprie informazioni ereditarie; è possibile la riproduzione controllata delle particelle virali nel corpo. Allo stesso tempo, per ridurre gli effetti collaterali, gli scienziati cercano di evitare di introdurre DNA geneticamente modificato nelle cellule degli organi genitali, evitando così l’impatto sui futuri discendenti del paziente.
Vale anche la pena notare la significativa critica a questa tecnologia nei media: lo sviluppo di virus geneticamente modificati è percepito da molti come una minaccia per tutta l'umanità.
Con l’aiuto della terapia genica in futuro sarà possibile modificare il genoma umano. Attualmente, metodi efficaci per modificare il genoma umano sono in fase di sviluppo e sperimentazione sui primati.
Ingegneria genetica di lunga data delle scimmiedovette affrontare serie difficoltà, ma nel 2009 gli esperimenti furono coronati da successo: sulla rivista Nature apparve una pubblicazione sull'uso riuscito di vettori virali geneticamente modificati per curare una scimmia maschio adulta dal daltonismo. Nello stesso anno, il primo primate geneticamente modificato (cresciuto da un uovo modificato) ha dato alla luce prole - marmoset comune (Callithrix jacchus).
Anche se su piccola scala, l’ingegneria genetica lo ha già fattoutilizzato per dare alle donne con determinati tipi di infertilità la possibilità di rimanere incinte. A questo scopo vengono utilizzate le uova di una donna sana. Di conseguenza, il bambino eredita il genotipo da un padre e due madri.
Tuttavia, la possibilità di introdurre più significativei cambiamenti nel genoma umano si trovano ad affrontare una serie di gravi problemi etici. Nel 2016, un gruppo di scienziati negli Stati Uniti ha ricevuto l'approvazione per le sperimentazioni cliniche di un metodo di trattamento del cancro utilizzando le cellule immunitarie del paziente, che sono geneticamente modificate utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9.
Alla fine del 2018 in Cina sono nati due bambini,il cui genoma è stato modificato artificialmente (il gene CCR5 è stato disattivato) in fase embrionale utilizzando il metodo CRISPR/Cas9, nell’ambito di una ricerca condotta dal 2016 per combattere l’HIV. Uno dei genitori (padre) era infetto da HIV e i bambini, secondo la dichiarazione, sono nati sani.
Poiché l'esperimento non era autorizzato (primaPertanto, tutti questi esperimenti sugli embrioni umani sono stati consentiti solo nelle prime fasi dello sviluppo con successiva distruzione del materiale sperimentale, cioè senza l'impianto dell'embrione nell'utero e la nascita di bambini), lo scienziato responsabile lo ha fatto Non fornire prove per le sue dichiarazioni, che sono state fatte ad una conferenza internazionale sull'editing del genoma.
Alla fine di gennaio 2019, le autorità cinesi hanno confermato ufficialmente i fatti di questo esperimento. Allo scienziato nel frattempo è stato vietato di svolgere attività scientifiche e lui è stato arrestato.
Come viene modificato il genoma umano?
- Metodo dita di zinco
"Dita di zinco" si trovano nella composizioneproteine umane. Grazie a questo metodo è possibile progettare una catena ZFN in modo che riconosca una specifica sezione di DNA. Ciò rende possibile indirizzare aree specifiche all'interno di genomi complessi.
I domini zinc finger si trovano infattori di trascrizione umani - proteine che regolano il processo di sintesi dell'RNA con il modello di DNA. Quando si creano nucleasi artificiali, è possibile costruire una catena di “dita di zinco” in modo che riconosca una sezione specifica del DNA.
Se una catena del genere è abbastanza lunga, alloraè in grado di riconoscere sequenze di DNA relativamente estese costituite da un numero di frammenti trinucleotidici. Ciò significa una reale possibilità di impatto mirato su aree specifiche all'interno di genomi grandi e complessi.
Tuttavia, è stato rivelato anche il metodo del “dito di zinco”.gravi svantaggi: in primo luogo, questo non è un riconoscimento molto rigoroso delle ripetizioni dei trinucleotidi, il che porta a un notevole numero di scissioni del DNA nelle regioni "non bersaglio".
In secondo luogo, il metodo si è rivelato molto laborioso ecostoso, poiché per ogni sequenza di DNA è necessario creare la propria struttura proteica ottimizzata di nucleasi a dito di zinco. Pertanto, il sistema "dita di zinco" non è molto diffuso.
- TALEN
Nel 2011, la rivista Nature Methods ha nominato il sistemaTALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) "metodo dell'anno" a causa di una vasta gamma di possibili applicazioni in diverse aree della scienza fondamentale e applicata.
TALEN è uno dei metodi di applicazione direttarottura nel DNA con la sua successiva "guarigione" - per disattivare i geni nei topi. Immediatamente dopo di loro, questa tecnologia è stata utilizzata per introdurre una mutazione nel genoma del topo, portando allo sviluppo di una delle sindromi ereditarie. Gli autori del metodo di modellazione delle malattie geneticamente determinate sono riusciti non solo a "rovinare" il genoma del topo, ma anche a correggerlo.
- CRISPR / Cas9
Il metodo fornisce un effetto accurato su regioni di DNA specificate e può essere utilizzato in quasi tutti i moderni laboratori di biologia molecolare.
Questo sistema si basa su aree specialiDNA batterico - CRISPR (ripetizioni palindromiche corte a intervalli regolari a intervalli regolari o brevi ripetizioni palindromiche a grappolo). Queste ripetizioni sono separate da spaziatori: brevi frammenti di DNA estraneo. Questi ultimi sono incorporati nel genoma dopo che il DNA si ricombina con il suo genoma.
Esempi di editing umano
- Modifica del genoma direttamente nel corpo
Malattia di Brian, 44 anni, residente in ArizonaMado si è manifestato nella prima infanzia. È incurabile ed è ereditato principalmente dagli uomini. La mucopolisaccaridosi di tipo II è una malattia metabolica: le persone con essa hanno una mutazione in un gene responsabile della produzione di un enzima coinvolto nella scomposizione dei carboidrati complessi. Di conseguenza, si accumulano nelle cellule e causano numerose patologie d'organo.
L'uomo ha deciso di prendere parte alla clinicatestare un nuovo metodo: la terapia genica. Questa è solo la prima fase dello studio e prima della registrazione della terapia (cioè prima dell'autorizzazione a utilizzare questo metodo per tutti i pazienti con sindrome di Hunter), devono essercene tre.
Metodo utilizzato nel caso di BrianMado ti consente di modificare il genoma direttamente nel corpo umano e allo stesso tempo mirare con precisione a una sezione specifica del DNA. La modifica avviene utilizzando le cosiddette "dita di zinco".
- Bambini geneticamente modificati
Il ricercatore cinese He Jiankui ha modificato i genomi degli embrioni umani prima della fecondazione in vitro, risultando in due bambini con DNA alterato.
Ricercatore di sistemi CRISPR / Cas9ha modificato i genomi di sette coppie di embrioni durante il trattamento riproduttivo. Come risultato di una delle gravidanze, due gemelle con DNA alterato sono nate da una madre sana e da un padre con infezione da HIV. He Jiankui ha spiegato di aver rimosso il gene CCR5 dai bambini, che ha dato loro l'immunità per tutta la vita contro l'HIV.
- Ritorno alla vista con la terapia genica
Per ripristinare la vista, è possibile utilizzare tecnologie optogenetiche, con l'aiuto delle quali è possibile controllare il lavoro dei neuroni con l'aiuto di proteine sensibili alla luce di batteri e lampi laser.
Guidati da questa idea, i biologi hanno creato un virus,che può penetrare nei neuroni gangliari. Queste cellule nervose sono responsabili della trasmissione dei segnali dalla retina al cervello umano. Una volta nella nevrosi gangliare, un virus fa sì che produca molecole di segnalazione simili. Tuttavia, questa procedura non ripristina la vista da sola, poiché le proteine dei batteri reagiscono alla luce in modo diverso dai bastoncelli e dai coni della retina.
Per risolvere questo problema, il professore di BasileaLa Botond Rosca University e il professor José Sahel dell'Università di Pittsburgh hanno creato occhiali speciali che trasformano l'immagine in arrivo in un formato comprensibile al cervello e stimolano le cellule gangliari con lampi laser. Di conseguenza, il paziente può vedere le sagome di oggetti e oggetti di grandi dimensioni ed eseguire altre azioni complesse.
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