L'RNA è stato visualizzato ad altissima risoluzione nelle cellule viventi

Il metodo si basa su un nuovo marcatore molecolare chiamato aptamero legante la rodamina per i metodi

imaging a super risoluzione (RhoBAST).Questo marcatore fluorescente a base di RNA viene utilizzato in combinazione con il colorante rodamina. Grazie alle loro proprietà distintive, il marcatore e il colorante interagiscono in un modo molto specifico, facendo brillare le singole molecole di RNA. Possono quindi essere resi visibili utilizzando la microscopia di localizzazione di singole molecole (SMLM), una tecnica di imaging a super risoluzione. A causa della mancanza di marcatori fluorescenti adatti, l’osservazione diretta dell’RNA mediante microscopia ottica a fluorescenza è stata fino ad oggi fortemente limitata.

RhoBAST è stato sviluppato dai ricercatori dell'Istitutodi Farmacia e Biotecnologia Molecolare (IPMB) presso l'Università di Heidelberg e l'Istituto di Fisica Applicata (APH) presso KIT. Il marcatore che hanno creato è geneticamente codificato, il che significa che può essere fuso con il gene di qualsiasi RNA prodotto dalla cellula. RhoBAST in sé non è fluorescente, ma illumina il colorante rodamina permeabile alle cellule, legandosi ad esso in modo molto specifico.

"Ciò porta ad un forte aumentofluorescenza ottenuta dal complesso RhoBAST, che è un requisito fondamentale per ottenere immagini di fluorescenza eccellenti. Tuttavia, per l’imaging dell’RNA a super risoluzione, il marcatore necessita di proprietà aggiuntive”.

Murat Zunbül dell'IPMB

I ricercatori hanno scoperto che ogni molecolail colorante di rodamina rimane legato a RhoBAST solo per un secondo circa prima di staccarsi nuovamente. Dopo pochi secondi, questa procedura viene ripetuta con una nuova molecola di colorante. È abbastanza raro trovare forti interazioni, ad esempio, tra RhoBAST e rodamina, combinate con cinetiche metaboliche estremamente veloci. Poiché la rodamina si accende solo dopo il legame con RhoBAST, la sequenza costante di interazioni riemergenti tra il marker e il colorante porta a un continuo "lampeggio". Questo on-off è esattamente ciò di cui hai bisogno per il rendering.

Allo stesso tempo, il sistema RhoBAST ne risolve un altroun problema importante. Le immagini fluorescenti vengono raccolte mediante l'esposizione alla luce laser, che nel tempo scompone le molecole del colorante. Il cambio rapido del colorante garantisce la sostituzione dei coloranti fotobiancati con altri freschi. Ciò significa che le singole molecole di RNA possono essere osservate per periodi di tempo più lunghi, il che può migliorare significativamente la risoluzione dell'immagine.

I ricercatori di Heidelberg e Karlsruhe sono riusciti a farlodimostrare le proprietà superiori di RhoBAST visualizzando le strutture dell'RNA all'interno di batteri intestinali (Escherichia coli) e cellule umane in coltura con una precisione di localizzazione superiore. Gli scienziati sono stati in grado di scoprire dettagli di strutture subcellulari e interazioni molecolari precedentemente invisibili che coinvolgono l'RNA utilizzando la microscopia a fluorescenza ad altissima risoluzione. Ciò fornirà una comprensione fondamentalmente nuova dei processi biologici.

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