Dmitrijus Madera, BIOCAD molekulinės genetikos katedros vedėjas, SPCFU vyresnysis dėstytojas, daktaras
2002 m. Jis baigė Maskvos valstybinio universiteto Biologijos fakultetąpagrindinė genetikos sritis. Masačusetso universitete jis apgynė biologijos mokslų daktaro laipsnį, pateiktą biofilosofijos daktaro laipsniu, po kurio dirbo Nacionaliniuose sveikatos institutuose, tyrė vėžio išsivystymo molekulinius aspektus ir kaip jiems paveikti. 2015 m. Jis vadovavo molekulinės genetikos laboratorijai BIOCAD, o nuo to laiko kuria genų terapijos produktus. Tarptautinio patento, kuriame aprašoma nauja „Cas9“ šeimos nukleazė ir straipsniai vėžio vystymosi srityje, autorius.
Jis Jiankui eksperimentas, gimusių mergaičių onkologijos rizika ir tikslinės mutacijos
Ką manote apie kinų biofiziko He Jiankui, kuris redagavo dviejų embrionų genomą, eksperimentą?Ekspertaireikalautikad gimusios mergaitės gali turėti mutacijų. Kaip to išvengti?— Ištyręs pirminį šaltinį (MIT — Hi-Tech tyrimas) ir genetiko Fiodoro Urnovo komentarą, supratau, kad žiniasklaida yra šiek tiek iškreiptaTaip, mergaitės dažniau turi mutacijų.Tai reiškia tas mutacijas, kurios nėra žinomos, kur tiksliai jos atsiras.Ir dabar sunku tiksliai nustatyti, kur atsirado atsitiktinės mutacijos, atsiradusios dėl CRISPR/Cas9.Norėdami tai padaryti, turite palyginti su mergaičių tėvais.
Formaliai tai yra teisingas teiginys: tikrai gali būti ofcinių mutacijų, ir nieko negalite padaryti.Ir dabartiniai genų redagavimo metodai tam netrukdo.būti pavojingas.
2018 metų pabaigoje kinų mokslininkas He Jiankuipaskelbė, kad sugeba sukurti genetiškai modifikuotas dvynukus, turinčius įgimtą imunitetą ŽIV. Jis sakė, kad suredagavo porų, kurioms buvo atliekamas IVF, embrionus, ir vienas iš septynių bandymų buvo sėkmingas. Eksperimentas sukėlė naują diskusijų bangą apie žmogaus genetinio kodo kišimosi etiką.
Tačiau redagavimo specialistas Fiodoras UrnovasKalifornijos universiteto genomas, pateikdamas interviu „MIT Technology Review“, pažymėjo: „Teiginys, kad jame atkurta vyraujanti CCR5, yra akivaizdus klaidingas pateikimas“ ir pridūrė, kad tai galima apibūdinti tik kaip „tyčinį klaidingą pateikimą“.
Naujas MIT tyrimas parodė, kad mokslininkai to nedarosugebėjo atkurti vyraujančią CCR5 versiją. Nors komanda siekė tinkamo geno, tyrėjai nenukopijavo norimo „Delta 32“ varianto, o vietoj to sukūrė naujus leidimus, kurių poveikis nėra aiškus - jie gali sukelti mutacijas.
Teiginys, kad He Jiankui negalėjo mutuoti CCR5 geno (geno, kuris leidžiaJis iš tikrųjų pasiekė savo tikslą, o CCR5 iš tikrųjų buvo mutavęs ir nebeveikia, o tai reiškia, kad ŽIV negali užkrėsti žmogaus ląstelių.Taip, matyt, nepavyko atkartoti konkretaus natūralaus alelio, randamo žmonių populiacijose, tačiau nepaisant to, CCR5 yra "išmuštas" ir neveikia, o tai reiškia, kad Jiankui pasiekė minimalų tikslą.
Norėdami išvengti tikslinių mutacijų,būtina patobulinti genomo redagavimo metodus ir padidinti jų tikslumą. Taigi ateityje bus įmanoma sumažinti mutacijų riziką iki foninio lygio ir tada nusiraminti dėl to, kad mutacijos vyksta natūraliai. Kaip sakoma, nebūtina būti šventesniam už popiežių.
- Tai yra, kai šios mergaitės užaugs, bus nerealu tiksliai suprasti, kokias mutacijas jos turėjo dėl Jiankui veiksmų?
- Kalbant konkrečiai apie CCR5, tada, žinoma,tai įmanoma. Ir visam genomui - iš principo, dabar įmanoma, jei paimsite jų tėvo ir motinos genetinę medžiagą ir palyginsite ją su jų pačių. Tuomet paaiškės, kokias galimybes turi tėvai, o kurios iš tų, kurios yra mergaičių genome, nei mama, nei tėtis neturi. Kitas dalykas yra tai, kad nebus įmanoma išsiaiškinti, kurios mutacijos atsirado dėl CRISPR / Cas, o kurios atsitiktinai. Galite palyginti tik šių mutacijų dažnį: kiek normalių mutacijų įvyksta gimus ir kiek šių mergaičių turi. Jei bus didesnės eilės daugiau, tada viskas aišku.
CRISPR/Cas9 genomo redagavimo technologija gali pašalinti tūkstančius paveldimų ligų, kurios anksčiau buvo laikomos nepagydomomis.
Pagrindinis skirtumas tarp genų įrankioredaguoti CRISPR / Cas9 iš kitų, pakankamai ilgų, egzistuojančių metodų - tai krypčių DNR pokyčių galimybė. CRISPR / Cas9 leidžia konkrečiai paveikti DNR seką ir net pakeisti suskaidytą geną į teisingą. Tam specialus fermentas nukleazė įveda spragą reikiamoje genomo vietoje, po kurio įjungiama taisymo sistema - vidiniai ląstelės mechanizmai genomui atkurti. Tokiu atveju DNR taisoma lūžio vietoje, kaip taisyklė, naudojant atsitiktines klaidas, dėl kurių greičiausiai bus prarasta ar įterpta keletas raidžių iš eilės ir atsiras mutacijų. Todėl ji ieško kaip norimos sekos kaimyninių genomų pavyzdžių. Pagal technologiją, ląstelė turi rasti šią seką specialiuose DNR fragmentuose. Jų genetika buvo įvesta į ląstelę, kad ji galėtų paimti ir savarankiškai įnešti į save. Tačiau atsitiktinės mutacijos plyšimo vietoje įvyksta daug dažniau, nei nukreiptos pataisos mėginyje.
Kitas klausimas, Konstantinas Severinovas (rusų molekulinės biologijos ir CRISPR/Cas – Hitech specialistas) kartą išreiškė įdomią mintį, kad jei ten būtų kažkas visiškai baisaus, mergaitės tiesiog nebūtų išgyvenusios embriogenezės stadijoje.Greičiausiai nieko esminio apie jų genomą nebuvo paveikta.Vienintelis dalykas, kuris mane gąsdina, yra onkologija.panašių ligų.
- Kodėl? Ar onkologija tampa labiau tikėtina taisant žmogaus genomą?
Pažvelkime į vėžio priežastis.Iš jų yra trys: paveldimos mutacijos, ty specialūs aleliai, turintyspadidėjusios vėžio rizikos tikimybė, pvz., Angelina Jolie; virusinės priežastys – pavyzdžiui, žmogaus papilomos virusas; ir atsitiktinės mutacijos.Bijau, kad kinijos eksperimento merginose atsiras pastarojo tipo mutacijų, ypač jei buvo didelis mutacijų dažnis.Šiuo atveju bet kokio tipo naviko atsiradimo tikimybė skiriasi nuo nulio.
Dmitrijus Madera. Nuotrauka: "Science Bar Hopping"
Kaip redaguoti žmogaus genomą, pirmaujančias šalis ir Rusijos genetikos likimą
- Kiek lengviau atlikti tokius eksperimentus su gyvūnais?
- Redaguoti kiekvieno gyvūno genomąjums reikia savo protokolo. Jums reikia redaguoti pelę arba karvę naudodami skirtingus protokolus. O žmogus, kaip ir kitas gyvūnas, pats reikalauja jo tobulėjimo, kad galėtų efektyviausiai redaguoti savo genomą. Todėl negalima sakyti, kad žmogų redaguoti sunkiau nei karvę. Tiesiog reikia daryti kitaip nei su pele ar žiurkėmis. Tačiau požiūriai išlieka tie patys. Pas mus nieko labai nesiskiria.
- Tai yraproblema slypi tik etikos ir įstatymų srityje? O jei būtų nuspręsta, ar būtų daugiau eksperimentų?
– Be jokios abejonės.Ir tada iš tikrųjų yra gana daug eksperimentų. Einu į konferencijas, dažnai susitinku su kolegomis. Pavyzdžiui, Oregono universitetas atlieka puikius žmogaus genomo redagavimo ir embrionų auginimo eksperimentus. Jie tiesiog vėliau sunaikinami tam tikru ankstyvu etapu. Tokie eksperimentai nėra draudžiami. Tiesą sakant, vienintelis apribojimas yra embriono implantavimas ir jo auginimas iki gimimo.
- Kurios šalys šiandien vadovauja žmogaus genomo redagavimo tyrimams?
— Dabar yra du tokie lyderiai, tarp jų ir visųlikusieji yra absoliuti bedugnė. Tai yra JAV ir Kinija. Niekas nėra dar arčiau, jie taip nutolę nuo likusio pasaulio savo tyrimuose.
- Ar tai susiję su finansavimu ar moksline baze?
- Su abiem.Kinija investuoja daug pinigų į mokslinius tyrimus, jų valdžia dėl to labai susirūpinusi. Ir jei anksčiau jie tiesiog kopijavo technologijas, tai dabar Kinijos mokslininkai daro įdomių dalykų. O JAV tiesiog labai stipri mokslinė bazė. Tiesą sakant, kur buvo atrasti visi šie CRISPR/Cas? Dauguma šio metodo atradėjų, išskyrus Jennifer Doudna, yra kinai, tačiau jie dirba JAV. Todėl tarp dviejų šalių buvo tokia sinergija.
— Kas trukdo Rusijai vystytis šioje srityje? Net prezidentaspaskelbtaapie tyrimų prioritetą genetikos kryptimi.
- Aš tai pasakysiu, šiandien jau yra finansavimastyrimams - skiriama daug pinigų. Bet, žinoma, visa tai nepadaroma per vieną valandą. Mums reikia mokslinės bazės ir mokyklos. Rusijoje, kalbant apie genetiką, viskas yra liūdna po lysenkoizmo. Iki Lysenko sovietinė genetikos mokykla buvo viena geriausių pasaulyje. Vavilovas nuvyko pas Morganą (Tomas Morganas - vienas iš genetikos įkūrėjų, Nobelio premijos laureatas - „Aukštosios technologijos“) ir jie bendravo vienodomis sąlygomis. Po Lysenko viskas buvo sunaikinta barbariškai. Ir nuo to laiko mes negalime atsigauti. Taip, pinigai yra labai svarbūs. Bet taip pat būtina, kad vaikai eitų mokytis, kad būtų įtraukti užsienio specialistai. O jei bus mokykla, tai bus ir genomo redagavimas Rusijoje.
- Kaip tam įtakos turės pastarojo meto rekomendacijos dėl Rusijos ir užsienio mokslininkų bendravimo - pranešti apie visus kontaktus, praktiškai bendrauti, kaip Sovietų Sąjungoje?
- Tai labai baisu. Blogiausias dalykas, kurį galima padaryti dėl Rusijos mokslo ir jį visiškai nužudyti, yra šios rekomendacijos. Aš suprantu, kad tai tik rekomendacijos ir jų nereikia laikytis. Bet žmonės, žinote, bijo. Ir jie pradeda juos vykdyti iniciatyviai. Ypač ne mokslininkai, o mokslo biurokratai. Jie pradės nebebendrauti su užsienio mokslininkais. Aš žinau istoriją, kai moksliniai sutuoktiniai iš Vokietijos kurį laiką atvyko į kokią nors konferenciją Rusijoje, o užsienio mokslininkai pas mus neina dažnai, todėl jiems nebuvo leista dalyvauti renginyje dėl šių reikalavimų. Mokslas yra tarptautinis, todėl reikia kiek įmanoma daugiau bendrauti ir bendrauti su kolegomis, tada bus gerai. Aš griežtai smerkiu šiuos reikalavimus.
Kurtumo, pavojingų ligų gydymas ir vaistų tiekimas
— Rusijos genetikas Denisas Rebrikovaseinant įredaguoti embrionų genomą poroms, turinčioms klausos sutrikimų. Kokia tokio eksperimento sėkmės tikimybė?
— Denisas Vladimirovičius atsižvelgė į visas savo klaidasKinijos kolega. Jis ketina atlikti viso genomo sekos nustatymą. O pats eksperimentas vyks labiau kontroliuojamoje aplinkoje, o ne pusiau požeminėmis sąlygomis, kaip buvo Jiankui atveju. Manau, kad sėkmė, iš principo, metodologiniu požiūriu, yra įmanoma, o pasirodo, viskas nėra taip baisu, ypač naudojant šiuolaikinius metodus. Ir mutacijos lygis gali būti fono lygyje. Kalbant apie šiuos sergančius vaikus, taip, tai yra monogeninė mutacija, ir ji yra dominuojanti, tai yra, ją gana lengva sunaikinti, ką genetikai jau daro gerai. Ir, tiesą sakant, viskas, toliau niekas netrukdo.
– Kaip tai dera su Rusijos teisės aktais?
- Dėl teisėkūros aspektų - Rebrikovastai tiesiog veikia tai. Ir šia prasme labai įdomu sužinoti, kas ten vyksta. Labai norėčiau, kad jam pavyktų pralaužti šią įstatymų leidžiamąją sieną. Nors jo pavyzdys ir liga, kurią jis pasirinko, daugelio mano kolegų ir mano nuomone, nėra tokie svarbūs. Bet laukas yra didžiulis, todėl tegul jis būna pirmasis ir parodykite gerą rezultatą. Ir toliau bus galima išplėsti „repertuarą“.
- Kokias kitas pavojingas ligas galima gydyti CRISPR / Cas?
– Žinoma, cistinė fibrozė yra labai rimtaliga. Gydant Diušeno raumenų distrofiją galima taikyti genų redagavimą, bent jau kai kuriems pacientams, kuriems yra tam daugiau ar mažiau tinkama mutacija. Apskritai, monogeninių genetinių ligų yra daugiau nei 10 tūkstančių.Ir čia klausimas, kuris metodas yra patogesnis ir paprastesnis gydyti. Pavyzdžiui, stuburo raumenų atrofija turėtų būti gydoma ne redagavimu, o tiesiog genų pakaitine terapija.
Cistinė fibrozė- sisteminės paveldimos ligos,sukelta cistinės fibrozės transmembraninio reguliatoriaus geno mutacijos ir pasižyminti išorinių sekrecijos liaukų pažeidimu bei sunkiu kvėpavimo organų disfunkcija. Cistinė fibrozė ypač domina ne tik dėl plačiai paplitusio paplitimo, bet ir dėl to, kad tai buvo viena pirmųjų paveldimų ligų, kuri buvo gydoma. Pirmą kartą cistinę fibrozę kaip atskirą esmę pripažino Dorothy Andersen 1938 m.
Diušeno miodistrofija- atsirado dėl vieno ištrynimo ar dubliavimoarba keli egzonai arba taškinės mutacijos distrofino gene. Pagrindinis pasireiškimas yra raumenų silpnumas, sunkumas judėti nuo vaikystės, kuris laikui bėgant progresuoja. Mirtis dažniausiai įvyksta antrą ar trečią gyvenimo dešimtmetį. Vidutinė jo trukmė – 25 metai, tačiau yra ir ilgiau gyvenančių.
- Kada mokslininkai galės tai padaryti? Koks yra laiko intervalas?
– Žiūrėk, gyvuliai jau gydomi.Tiesa, pirmiausia jie, žinoma, „sužaloja“ (tai yra, daro pavyzdinius gyvūnus ligoms tirti), o tada gydo. Bet visa tai ateina tik į sąmoningą kliniką ir, kaip taisyklė, trunka nuo 5 iki 15 metų. Ir kaip suprantu, kadangi tai visiškai naujas požiūris, pirmieji klinikiniai tyrimai užtruks labai ilgai. Tai reiškia, kad teks laukti 15–20 metų. Tada atrodys taip: atvažiuokite, nustatykite diagnozę ir iš karto gydykite.
Dmitrijus Madera. Nuotrauka: mokslo baras „Hopping“
- Tai yra, svarbu ne embrionų genomo redagavimas, o suaugusiųjų gydymas?
— Galimi abu būdai.
- Pakalbėkim apiegenų redagavimasbe dvigubo lūžimo. Kodėl mokslininkai negalėjo to padaryti anksčiau?
— Дело в том, что это совсем нелегко.Kai pirmą kartą perskaičiau leidinį „Nature“, pagalvojau: „O kaip aš apie tai nepagalvojau? Anekdotai, tai buvo daug darbo, nes iš pradžių buvo panaši idėja, tačiau kai mokslininkai pabandė, jiems nepavyko. Tada jie pradėjo keisti atvirkštinę transkriptazę, iš esmės ją mutuodami, kad ji veiktų kitaip. Ir jau tam tikroje iteracijoje jis pradėjo veikti ir pradėjo gaminti kažką panašaus. Tai buvo daug laiko ir finansavimo pareikalavęs procesas. Todėl nesistebiu, kad nuo tiesiog CRISPR/Cas išradimo iki atvirkštinės transkriptazės metodo atsiradimo praėjo laikas. Nes tai nebanalu.
- Kokias galimybes atveria šis naujas metodas?
- Galimybės yra puikios, nes dabarPasirodo, kad esant minimaliai ofsetinių mutacijų atsiradimo rizikai, mes galime labai konkrečiai pakeisti bet kurį geną, alelį. Pvz., Jei norime nustatyti taškinę mutaciją, sukurkite trynimą arba kompleksinį pakaitalą. Tai suteikia mums puikių galimybių, nes paprastai viena ar dvi mutacijos ar delecijos yra mažos ir jas galima atstatyti per 40–50 nukleotidų.
Tiesą sakant, buvo technologijos šiek tiek anksčiau -nukleotidų redaktoriai, kurie tiesiog paėmė ir pakeitė, pavyzdžiui, „A“ į „G“ arba „C“ į „T“. Tokie kūriniai buvo ir yra naudojami iki šiol, tačiau, žinoma, viskas ten nėra paprasta, nes paaiškėja, kad jie redaguoja ne tik DNR, bet ir RNR, ir nesako, kad tai labai didelis - jie tiksliai neredaguoja vienas nukleotidas ir visas „langas“. Galbūt tai vėliau taip pat taps praktiniu naudojimu. Tačiau kol kas yra daugybė problemų. Prisiminiau šį metodą, nes jis taip pat nereikalauja dvigubų pertraukų. Ir ji atsirado šiek tiek anksčiau nei šie naujausi tyrimai.
— MIT ir Harvardo universitetų inžinieriainaudotasCRISPR sukurti vaistų tiekimo sistemą, kuri juos išleistų tik tam tikru momentu. Kaip tiksliai tai vyksta?
- Kalbant konkrečiai apie šį metodą, tada jisesmė ta, kad DNR yra polimeras, o Cas12a ją suskaldo, sunaikindamas polimero struktūrą. Jei DNR yra įtraukta į hidrogelį, tada iš jo išsiskiria medžiagos, kurios anksčiau buvo fiksuotos hidrogelyje su DNR grandinėmis. Tai yra, čia DNR veikia tiesiog kaip fizinė medžiaga, kurią galima skaidyti kontroliuojamu būdu. Paprastai hidrogeliai naudojami ant žaizdų ir kitų sužalojimų, kai reikia palaipsniui iš jų išleisti vaistus.
Iš esmės CRISPR/Cas galėtų ką nors pristatytibūtinas genomo padėčiai. Tai viskas, ką jis gali padaryti. Tačiau jis negali pristatyti vaisto į ląstelę. Taigi kalbėti apie jo naudojimą vaistams pristatyti nėra visiškai teisinga.
Tačiau pristatyti CRISPR / Cas asnarkotikų į ląstelę, reikalingi pristatymo būdai. Ir jie egzistuoja - jie gali būti virusiniai ir nevirusiniai. Virusai, žinoma, vystėsi per visą istoriją, kad į ląstelę galėtų patekti tam tikra genetinė medžiaga. Jie dauginasi taip. Nevirusiniai metodai yra tiesiog cheminiai metodai, kai sukuriami kai kurie nešiotojai, kurių viduje yra nukleorūgšties molekulės, nebūtinai DNR, beje, tai netgi gali būti RNR arba baltymai. Paprastai tai yra keli riebalų lašeliai, kurie apsaugo tai, ko jiems reikia iš nukleazių ir proteazių, o antikūnai taip pat gali būti pakabinami ant jų, kad jie būtų specifiški tam tikrai ląstelei. Ir šie lipofiliniai kompleksai pristato vaistus į ląstelę. Yra darbų, susijusių su sudėtiniais polimerais ar aukso nanodalelėmis, kurie, kaip patranka, apdegina ląsteles, į juos skraido ir perduoda jų turinį, pavyzdžiui, genominę patranką.
- Ar dėl genų redagavimo įmanoma žymiai prailginti žmogaus gyvenimą? Kiek tai galima padaryti ir kokias ligas reikia tokiu būdu išgydyti?
- Sudėtingas klausimas.Faktas yra tas, kad yra mutacijų, kurios gyvūnams sukelia tam tikrą gyvenimo pailgėjimą, senėjimo sulėtėjimą. Paprastai jie yra susiję su DNR taisymo sistema. Daugeliu atžvilgių senėjimas yra atsitiktinių klaidų, dėl kurių suaktyvėja retrovirusiniai elementai, pasekmė, todėl genomas nėra reguliuojamas ir pradeda veikti prieš savo šeimininką. Čia yra prasmė, mes nežinome, kaip tai veiks žmonėms. Deja, ir tai labai nustebino, senėjimo ir apsaugos nuo jo mechanizmai yra labai specifiniai rūšiai. Ir žmonėms tos pačios pelės nėra visiškai tinkamas modelis. Ir kuo tinkamesnis modelis ir kuo ilgiau jis tarnauja, tuo sunkiau su juo dirbti. Pavyzdžiui, tas pats SIRT6 - ilgaamžėse rūšyse jis yra vienas, o trumpaamžių rūšių skiriasi, yra aiški koreliacija. Atrodė, kad paimkite ir įkiškite SIRT6 iš dramblio į žmogų. Arba kelios žmogaus SIRT6 kopijos (genas, koduojantis sirtuino-6 baltymą, padeda ištaisyti DNR pažeidimus – dvigubos grandinės pertraukas ir genetinių nukleotidų raidžių pakaitus – Hi-Tech). Tai gali veikti arba ne. Yra tokia galimybė, ir aš, žinoma, pabandysiu. Bet jei mes kalbame apie gyvenimo pratęsimą, greičiausiai turėsime redaguoti genus, susijusius su DNR taisymu. Tačiau šiandien tokiam organizmui kaip žmogui tai tik hipotezė.