Genų inžinerijos taikymas moksliniuose tyrimuose
- Genų nokautas
Ištirti vieno ar kito funkciją
Nokautui tas pats genas ar jo fragmentas yra sintetinamas, modifikuojamas taip, kad geno produktas prarastų savo funkciją. Pagrindiniai įgyvendinimo būdai: cinko pirštas, morfolinas ir TALEN.
Norėdami gauti nokautas peles, gautasGenetiškai modifikuotas konstruktas įvedamas į embrionines kamienines ląsteles, kur konstrukcija vykdo somatinę rekombinaciją ir pakeičia įprastą geną, o pakitusios ląstelės implantuojamos į pakaitinės motinos blastocistą. Vaisių musėje Drosophila mutacijos pradedamos didelėje populiacijoje, kurioje vėliau ieškoma palikuonių su norima mutacija. Augalai ir mikroorganizmai išmušami panašiai.
- Dirbtinė išraiška
Logiškas papildymas nokautu yradirbtinė išraiška, tai yra kūno pridėjimas geno, kurio jis anksčiau neturėjo. Ši genų inžinerijos technika taip pat gali būti naudojama genų funkcijai tirti. Iš esmės papildomų genų įvedimo procesas yra toks pats kaip ir išjungimo, tačiau esami genai nėra pakeisti ar pažeisti.
- Genų produktų vizualizavimas
Naudojamas, kai užduotis yra mokytisgeno produkto lokalizacija. Vienas iš žymėjimo metodų yra pakeisti įprastą geną, sujungtą su reporterio elementu, pavyzdžiui, su žaliu fluorescencinio baltymo genu GFP. Šis mėlynoje šviesoje fluorescuojantis baltymas naudojamas genetinės modifikacijos produktui vizualizuoti.
Nors ši technika yra patogi ir naudinga, jos šalutinis poveikispasekmės gali būti dalinis arba visiškas tiriamo baltymo funkcijos praradimas. Įmantresnis, nors ir ne toks patogus metodas yra pridėti prie tiriamo baltymo ne tokius didelius oligopeptidus, kuriuos galima aptikti naudojant specifinius antikūnus.
- Išraiškos mechanizmo tyrimas
Tokiuose eksperimentuose užduotis yra mokytisgenų ekspresijos sąlygos. Ekspresijos ypatybės pirmiausia priklauso nuo mažos DNR dalies, esančios prieš kodavimo sritį, vadinamą promotoriumi, kuris suriša transkripcijos faktorius.
Ši svetainė įvedama į kūną dedant povietoj savo reporterio geno, pavyzdžiui, GFP arba fermentas, kuris katalizuoja lengvai aptiktą reakciją. Be to, kad promotoriaus veikimas tam tikruose audiniuose vienu ar kitu metu tampa aiškiai matomas, tokie eksperimentai leidžia ištirti promotoriaus struktūrą pašalinant ar pridedant prie jo DNR fragmentus, taip pat dirbtinai sustiprinti jo funkcijos.
Kodėl reikalinga žmogaus genų inžinerija?
Taikant žmonėms, genų inžinerija galėtųvartojamas paveldimoms ligoms gydyti. Tačiau techniškai yra didelis skirtumas tarp paties paciento gydymo ir jo palikuonių genomo modifikavimo.
Užduotis pakeisti suaugusiųjų genomąyra šiek tiek sudėtingesnis nei naujų genetiškai modifikuotų veislių gyvūnų veisimas, nes tokiu atveju reikia pakeisti daugelio jau susiformavusio organizmo ląstelių genomą, o ne tik vieną embriono kiaušinėlį. Norėdami tai padaryti, kaip vektorių siūloma naudoti virusines daleles.
Virusinės dalelės gali prasiskverbti įnemaža dalis suaugusių ląstelių, įterpiančių į jas savo paveldimą informaciją; galimas kontroliuojamas viruso dalelių dauginimasis organizme. Tuo pačiu metu, siekdami sumažinti šalutinį poveikį, mokslininkai stengiasi išvengti genetiškai modifikuotos DNR patekimo į lytinių organų ląsteles, taip išvengiant poveikio būsimiems paciento palikuonims.
Taip pat verta atkreipti dėmesį į reikšmingą šios technologijos kritiką žiniasklaidoje: genų inžinerijos būdu sukurtų virusų vystymąsi daugelis suvokia kaip grėsmę visai žmonijai.
Genų terapijos pagalba ateityje įmanoma pakeisti žmogaus genomą. Šiuo metu veiksmingi žmogaus genomo modifikavimo metodai yra kuriami ir bandomi su primatais.
Ilgalaikė beždžionių genų inžinerijasusidūrė su rimtais sunkumais, tačiau 2009 metais eksperimentus vainikavo sėkmė: žurnale „Nature“ pasirodė publikacija apie sėkmingą genetiškai modifikuotų virusinių vektorių panaudojimą suaugusiam beždžionės patinui išgydyti nuo daltonizmo. Tais pačiais metais pasirodė pirmasis genetiškai modifikuotas primatas (išauginta iš modifikuoto kiaušinėlio) susilaukė palikuonių – paprastosios kiaunės (.Callithrix jacchus).
Nors ir nedideliu mastu, genų inžinerija jau padarėnaudojamas tam, kad moterys, turinčios tam tikrų tipų nevaisingumą, galėtų pastoti. Tam naudojami sveikos moters kiaušinėliai. Dėl to vaikas paveldi genotipą iš vieno tėvo ir dviejų motinų.
Tačiau galimybė įvesti reikšmingesniusžmogaus genomo pokyčiai susiduria su daugybe rimtų etinių problemų. 2016 m. Grupė mokslininkų JAV gavo patvirtinimą klinikiniams vėžio gydymo metodo tyrimams, naudojant paciento imunines ląsteles, kurios yra genetiškai modifikuotos naudojant CRISPR / Cas9 technologiją.
2018 metų pabaigoje Kinijoje gimė du vaikai,kurių genomas buvo dirbtinai pakeistas (CCR5 genas buvo išjungtas) embriono stadijoje, naudojant CRISPR/Cas9 metodą, kaip dalis nuo 2016 metų vykdomų tyrimų, skirtų kovai su ŽIV. Vienas iš tėvų (tėvas) buvo užsikrėtęs ŽIV, o vaikai, pasak pareiškimo, gimė sveiki.
Kadangi eksperimentas buvo neteisėtas (priešTodėl visi tokie eksperimentai su žmogaus embrionais buvo leidžiami tik ankstyvosiose vystymosi stadijose, vėliau sunaikinant eksperimentinę medžiagą, tai yra be embriono implantavimo į gimdą ir vaikų gimimo), tai padarė už tai atsakingas mokslininkas. nepateikė įrodymų savo teiginiams, kurie buvo padaryti tarptautinėje konferencijoje apie genomo redagavimą.
2019 metų sausio pabaigoje Kinijos valdžia oficialiai patvirtino šio eksperimento faktus. Tuo tarpu mokslininkui buvo uždrausta užsiimti moksline veikla ir jis buvo suimtas.
Kaip redaguojamas žmogaus genomas?
- Cinko pirštų metodas
Kompozicijoje taip pat yra „cinko pirštų“žmogaus baltymų. Šio metodo dėka galima suprojektuoti ZFN grandinę taip, kad ji atpažintų tam tikrą DNR sekciją. Tai leidžia nukreipti į konkrečias sudėtingų genomų sritis.
Cinko pirštų domenai randamižmogaus transkripcijos faktoriai – baltymai, reguliuojantys RNR sintezės procesą su DNR šablonu. Kuriant dirbtines nukleazes galima sukonstruoti „cinko pirštų“ grandinę, kad ji atpažintų tam tikrą DNR atkarpą.
Jei tokia grandinė yra pakankamai ilga, taigali atpažinti palyginti išplėstines DNR sekas, susidedančias iš daugybės trinukleotidų fragmentų. Tai reiškia realią galimybę tikslingai paveikti konkrečias didelių sudėtingų genomų sritis.
Tačiau „cinko piršto“ metodas taip pat atskleidėrimti trūkumai: pirma, tai nėra visiškai griežtas trinukleotidų pasikartojimų atpažinimas, dėl kurio pastebimas DNR skilimas „netiksliniuose“ regionuose.
Antra, metodas pasirodė labai sunkus irbrangu, nes kiekvienai DNR sekai būtina sukurti savo optimizuotą cinko pirštų nukleazių baltymų struktūrą. Todėl sistema „cinko pirštai“ nėra plačiai paplitusi.
- TALENAS
2011 metais žurnalas „Nature Methods“ pavadino sistemąTALEN („Transcription Activator-like Effector Nucleases“) „Metų metodas“ dėl daugybės galimų pritaikymų įvairiose fundamentinio ir taikomojo mokslo srityse.
TALEN yra vienas iš tikslinio taikymo būdųsulaužyti DNR su vėlesniu jos „išgydymu“ - išjungti pelių genus. Iškart po jų ši technologija buvo panaudota įvedus mutaciją į pelės genomą, dėl kurio atsirado vienas iš paveldimų sindromų. Genetiškai nulemtų ligų modeliavimo metodo autoriams pavyko ne tik „sugadinti“ pelės genomą, bet ir jį ištaisyti.
- CRISPR / Cas9
Šis metodas suteikia tikslų poveikį nurodytoms DNR sritims ir gali būti naudojamas beveik bet kurioje šiuolaikinėje molekulinės biologijos laboratorijoje.
Ši sistema pagrįsta specialiomis sritimisbakterinė DNR - CRISPR (klasteriškai reguliariai susikertantys trumpi palindrominiai pakartojimai arba trumpi palindrominės klasterio kartojimai). Šiuos kartojimus atskiria tarpikliai - trumpi svetimos DNR fragmentai. Pastarosios yra įtrauktos į genomą po to, kai DNR rekombinuojasi su jo genomu.
Žmonių redagavimo pavyzdžiai
- Genomo redagavimas tiesiai kūne
44 metų Arizonos gyventojo Briano ligaMado pasireiškė ankstyvoje vaikystėje. Tai nepagydoma ir dažniausiai paveldima vyrų. II tipo mukopolisacharidozė yra medžiagų apykaitos sutrikimas: ja sergantys žmonės turi mutaciją genuose, atsakinguose už fermento, dalyvaujančio skaidant sudėtingus angliavandenius, gamybą. Dėl to jie kaupiasi ląstelėse ir sukelia daugybę organų patologijų.
Vyras nusprendė dalyvauti klinikinėjeišbandant naują metodą – genų terapiją. Tai tik pirmasis tyrimo etapas, o prieš registruojant terapiją (ty prieš suteikiant leidimą naudoti šį metodą visiems Hunterio sindromu sergantiems pacientams) jų turi būti trys.
Briano atveju naudojamas metodas„Mado“ leidžia redaguoti genomą tiesiogiai žmogaus kūne – ir tuo pat metu tiksliai nukreipti į konkrečią DNR dalį. Redaguojama naudojant vadinamuosius „cinko pirštelius“.
- Genetiškai modifikuoti vaikai
Kinų tyrėjas He Jiankui prieš apvaisinimą in vitro redagavo žmogaus embrionų genomus, todėl du vaikai turėjo pakitusią DNR.
CRISPR / Cas9 sistemos tyrinėtojasreprodukcinio gydymo metu redagavo septynių porų embrionų genomus. Dėl vieno iš nėštumų iš sveikos motinos ir ŽIV užsikrėtusio tėvo gimė dvi mergaitės dvynės su pakitusi DNR. Jis Jiankui paaiškino, kad pašalino vaikams CCR5 geną, kuris suteikė jiems visą gyvenimą trunkantį imunitetą nuo ŽIV.
- Regėjimo grąžinimas naudojant genų terapiją
Norint atkurti regėjimą, gali būti naudojamos optogenetinės technologijos, kurių pagalba galima valdyti neuronų darbą šviesai jautrių bakterijų baltymų ir lazerio blyksčių pagalba.
Vadovaudamiesi šia idėja, biologai sukūrė virusą,kurie gali prasiskverbti į ganglioninius neuronus. Šios nervinės ląstelės yra atsakingos už signalų perdavimą iš tinklainės į žmogaus smegenis. Patekęs į ganglioninę neurozę, virusas priverčia jį gaminti panašias signalines molekules. Tačiau ši procedūra savaime neatstato regėjimo, nes bakterijų baltymai į šviesą reaguoja skirtingai nei tinklainės strypai ir kūgiai.
Norėdami išspręsti šią problemą, Bazelio profesoriusBotond Rosca universitetas ir Pitsburgo universiteto profesorius José Sahel sukūrė specialius akinius, kurie paverčia gaunamą vaizdą smegenims suprantamu formatu ir lazerio blyksnėmis stimuliuoja gangliono ląsteles. Dėl to pacientas gali matyti didelių objektų ir objektų siluetus ir atlikti kitus sudėtingus veiksmus.
Skaityti daugiau:
Mokslininkai išbandė panspermijos teoriją tardigradais: jie gali keliauti kosmose
Mokslininkai nustatė, kad itin prisodrintas auksas susidaro kaip jogurtas
Mažas vandenilio variklis pakeičia iškastinio kuro analogus