Gēnu inženierijas pielietojums zinātniskos pētījumos
- Gēnu nokauts
Izpētīt viena vai otra funkciju
Nokautam tiek sintezēts viens un tas pats gēns vai tā fragments, modificēts tā, ka gēna produkts zaudē savu funkciju. Galvenās ieviešanas metodes: cinka pirksts, morfolino un TALEN.
Lai iegūtu nokautās peles, iegūtoĢenētiski modificētā konstrukcija tiek ievadīta embriju cilmes šūnās, kur konstrukcija tiek pakļauta somatiskai rekombinācijai un aizstāj normālo gēnu, un izmainītās šūnas tiek implantētas surogātmātes blastocistā. Augļu mušiņā lielā populācijā tiek uzsāktas Drosophila mutācijas, kurās pēc tam tiek meklēti pēcnācēji ar vēlamo mutāciju. Līdzīgi tiek izsisti augi un mikroorganismi.
- Mākslīgā izpausme
Loģisks papildinājums nokautam irmākslīga izpausme, tas ir, gēna pievienošana ķermenim, kāda tam agrāk nebija. Šo gēnu inženierijas paņēmienu var izmantot arī gēnu funkcijas izpētei. Būtībā papildu gēnu ieviešanas process ir tāds pats kā nokautēšanai, bet esošie gēni netiek aizstāti vai bojāti.
- Gēnu produkta vizualizācija
Izmanto, ja uzdevums ir mācītiesgēnu produkta lokalizācija. Viena no marķēšanas metodēm ir aizstāt parasto gēnu ar tādu, kas sakausēts ar reportiera elementu, piemēram, ar zaļo fluorescējošā proteīna gēnu GFP. Šis proteīns, kas fluorescē zilā gaismā, tiek izmantots, lai vizualizētu ģenētiskās modifikācijas produktu.
Lai gan šī tehnika ir ērta un noderīga, tās blakusparādībassekas var būt daļēja vai pilnīga pētāmā proteīna funkciju zaudēšana. Sarežģītāka, kaut arī ne tik ērta metode ir pētāmajam proteīnam pievienot ne tik lielus oligopeptīdus, kurus var noteikt, izmantojot specifiskas antivielas.
- Izteiksmes mehānisma izpēte
Šādos eksperimentos uzdevums ir pētītgēnu ekspresijas apstākļi. Ekspresijas pazīmes galvenokārt ir atkarīgas no neliela DNS gabala, kas atrodas kodējošā reģiona priekšā, ko sauc par promotoru, kas kalpo, lai saistītu transkripcijas faktorus.
Šī vietne tiek ievadīta ķermenī, ievietojot pēcsava reportiera gēna vietā, piemēram, GFP vai fermentu, kas katalizē viegli nosakāmu reakciju. Papildus tam, ka promotora darbība noteiktos audos vienā vai otrā laikā kļūst skaidri redzama, šādi eksperimenti ļauj izpētīt promotora struktūru, noņemot vai pievienojot tam DNS fragmentus, kā arī mākslīgi uzlabot tā darbību funkcijas.
Kāpēc ir nepieciešama cilvēka gēnu inženierija?
Lietojot cilvēkiem, gēnu inženierija varētulieto iedzimtu slimību ārstēšanai. Tomēr tehniski pastāv būtiska atšķirība starp paša pacienta ārstēšanu un viņa pēcnācēju genoma modificēšanu.
Pieaugušā genoma maiņas uzdevumsir nedaudz sarežģītāka nekā jaunu ģenētiski modificētu dzīvnieku šķirņu audzēšana, jo šajā gadījumā ir jāmaina ne tikai vienas embrija olas, bet daudzu jau izveidota organisma šūnu genoms. Lai to izdarītu, kā vektoru tiek ierosināts izmantot vīrusu daļiņas.
Vīrusu daļiņas spēj iekļūtievērojams procents pieaugušo šūnu, iekļaujot tajās savu iedzimto informāciju; ir iespējama vīrusu daļiņu kontrolēta vairošanās organismā. Tajā pašā laikā, lai mazinātu blakusparādības, zinātnieki cenšas izvairīties no ģenētiski modificētas DNS ievadīšanas dzimumorgānu šūnās, tādējādi izvairoties no ietekmes uz pacienta nākamajiem pēcnācējiem.
Ir arī vērts atzīmēt šīs tehnoloģijas ievērojamo kritiku plašsaziņas līdzekļos: ģenētiski modificētu vīrusu attīstību daudzi uztver kā draudus visai cilvēcei.
Ar gēnu terapijas palīdzību nākotnē ir iespējams mainīt cilvēka genomu. Pašlaik efektīvas metodes cilvēka genoma modificēšanai ir izstrādes stadijā un testē uz primātiem.
Ilgstoša pērtiķu gēnu inženierijasaskārās ar nopietnām grūtībām, taču 2009. gadā eksperimenti vainagojās panākumiem: žurnālā Nature parādījās publikācija par ģenētiski modificētu vīrusu vektoru veiksmīgu izmantošanu pieauguša pērtiķa tēviņa izārstēšanai no daltonisma.Tajā pašā gadā parādījās pirmais ģenētiski modificētais primāts. (audzēta no modificētas olas) dzemdēja pēcnācējus - parastā marmozete (Callithrix jacchus).
Lai gan nelielā mērogā, gēnu inženierija jau irizmanto, lai sievietēm ar noteiktiem neauglības veidiem būtu iespēja palikt stāvoklī. Tam izmanto veselas sievietes olas. Rezultātā bērns manto genotipu no viena tēva un divām mātēm.
Tomēr iespēja ieviest nozīmīgākuizmaiņas cilvēka genomā saskaras ar vairākām nopietnām ētiskām problēmām. 2016. gadā ASV zinātnieku grupa saņēma apstiprinājumu vēža ārstēšanas metodes klīniskajiem izmēģinājumiem, izmantojot paša pacienta imūnās šūnas, kuras ģenētiski modificētas, izmantojot CRISPR / Cas9 tehnoloģiju.
2018. gada beigās Ķīnā piedzima divi bērni,kuru genoms tika mākslīgi mainīts (CCR5 gēns tika izslēgts) embrija stadijā, izmantojot CRISPR/Cas9 metodi, kā daļa no pētījumiem, kas veikti kopš 2016. gada HIV apkarošanai. Viens no vecākiem (tēvs) bija HIV inficēts, un bērni, pēc paziņojuma, piedzima veseli.
Tā kā eksperiments bija neatļauts (pirmsTāpēc visi šādi eksperimenti ar cilvēka embrijiem bija atļauti tikai agrīnās attīstības stadijās ar sekojošu eksperimentālā materiāla iznīcināšanu, tas ir, bez embrija implantācijas dzemdē un bērnu piedzimšanas), to izdarīja par to atbildīgais zinātnieks. nesniedz pierādījumus viņa izteikumiem, kas tika izteikti starptautiskā konferencē par genoma rediģēšanu.
2019. gada janvāra beigās Ķīnas varas iestādes oficiāli apstiprināja šī eksperimenta faktus. Tikmēr zinātniekam bija aizliegts iesaistīties zinātniskā darbībā, un viņš tika arestēts.
Kā tiek rediģēts cilvēka genoms?
- Cinka pirkstu metode
Sastāvā atrodami arī "cinka pirkstiņi"cilvēka olbaltumvielas. Pateicoties šai metodei, ir iespējams izveidot ZFN ķēdi tā, lai tā atpazītu noteiktu DNS sadaļu. Tas ļauj atlasīt mērķauditoriju noteiktos apgabalos sarežģītos genomos.
Cinka pirkstu domēni ir atrodamicilvēka transkripcijas faktori – proteīni, kas ar DNS veidni regulē RNS sintēzes procesu. Veidojot mākslīgās nukleāzes, ir iespējams izveidot “cinka pirkstu” ķēdi tā, lai tā atpazītu noteiktu DNS daļu.
Ja šāda ķēde ir pietiekami gara, tadvar atpazīt salīdzinoši paplašinātas DNS sekvences, kas sastāv no vairākiem trinukleotīdu fragmentiem. Tas nozīmē reālu iespēju mērķtiecīgi ietekmēt konkrētas teritorijas lielos sarežģītos genomos.
Tomēr atklājās arī “cinka pirksta” metodenopietni trūkumi: pirmkārt, tā nav ļoti stingra trinukleotīdu atkārtojumu atpazīšana, kas noved pie ievērojama DNS šķelšanās skaita “nemērķa” reģionos.
Otrkārt, metode izrādījās ļoti darbietilpīga undārgi, jo katrai DNS secībai ir jāizveido sava optimizētā cinka pirkstu nukleāžu proteīnu struktūra. Tāpēc sistēma "cinka pirksti" nav plaši izplatīta.
- TALENS
2011. gadā žurnāls Nature Methods nosauca sistēmuTALEN (transkripcijas aktivatoram līdzīgi efektoru nukleāzes) "gada metode", pateicoties plašam iespējamo pielietojumu klāstam dažādās fundamentālās un lietišķās zinātnes jomās.
TALEN ir viena no mērķtiecīgas pielietošanas metodēmDNS pārtraukums ar tam sekojošu "dziedināšanu" - lai izslēgtu gēnus pelēm. Tūlīt pēc tiem šī tehnoloģija tika izmantota, lai peles genomā ievadītu mutāciju, kā rezultātā attīstījās viens no iedzimtiem sindromiem. Ģenētiski noteikto slimību modelēšanas metodes autoriem izdevās ne tikai "sabojāt" peles genomu, bet arī to labot.
- CRISPR / Cas9
Metode nodrošina precīzu ietekmi uz noteiktiem DNS reģioniem, un to var izmantot gandrīz jebkurā mūsdienu molekulārajā bioloģiskajā laboratorijā.
Šī sistēma ir balstīta uz īpašām zonāmbaktēriju DNS - CRISPR (klasteriski regulāri ievietoti īsi palindromiski atkārtojumi vai īsas palindromiskas kopas atkārtojumi). Šos atkārtojumus atdala starplikas - īsi svešas DNS fragmenti. Pēdējie tiek iekļauti genomā pēc DNS rekombinācijas ar tā genomu.
Cilvēka rediģēšanas piemēri
- Genoma rediģēšana tieši ķermenī
44 gadus vecā Arizonas iedzīvotāja Braiena slimībaMado izpaudās agrā bērnībā. Tas ir neārstējams, un to pārmanto galvenokārt vīrieši. II tipa mukopolisaharidoze ir vielmaiņas traucējumi: cilvēkiem ar to ir gēna mutācija, kas ir atbildīga par fermenta ražošanu, kas ir iesaistīts sarežģītu ogļhidrātu sadalīšanā. Tā rezultātā tie uzkrājas šūnās un izraisa daudzas orgānu patoloģijas.
Vīrietis nolēma piedalīties klīniskajātestējot jaunu metodi – gēnu terapiju. Šī ir tikai pirmā pētījuma fāze, un pirms terapijas reģistrācijas (tas ir, pirms atļaujas izmantot šo metodi visiem pacientiem ar Hantera sindromu), tiem jābūt trim.
Braiena gadījumā izmantotā metodeMado ļauj rediģēt genomu tieši cilvēka ķermenī - un tajā pašā laikā precīzi mērķēt uz noteiktu DNS sadaļu. Rediģēšana notiek, izmantojot tā sauktos “cinka pirkstus”.
- Ģenētiski modificēti bērni
Ķīniešu pētnieks He Jiankui pirms apaugļošanas in vitro rediģēja cilvēka embriju genomus, kā rezultātā radās divi bērni ar izmainītu DNS.
CRISPR / Cas9 sistēmas pētnieksreproduktīvās ārstēšanas laikā rediģēja septiņu pāru embriju genomus. Vienas no grūtniecībām divas veselīgas mātes un HIV inficēta tēva pasaulē nāca divas dvīņu meitenes ar izmainītu DNS. Viņš Jiankui paskaidroja, ka noņēma bērniem CCR5 gēnu, kas viņiem deva mūža imunitāti pret HIV.
- Redzes atjaunošana ar gēnu terapiju
Redzes atjaunošanai var izmantot optoģenētiskās tehnoloģijas, ar kuru palīdzību var kontrolēt neironu darbu, izmantojot gaismu jutīgās baktēriju olbaltumvielas un lāzera zibspuldzes.
Šīs idejas vadīti, biologi ir radījuši vīrusu,kas var iekļūt gangliona neironos. Šīs nervu šūnas ir atbildīgas par signālu pārraidi no tīklenes uz cilvēka smadzenēm. Nokļūstot ganglioniskajā neirozē, vīruss liek tam ražot līdzīgas signalizācijas molekulas. Tomēr šī procedūra neatjauno redzi pati par sevi, jo baktēriju olbaltumvielas reaģē uz gaismu atšķirīgi no tīklenes stieņiem un konusiņiem.
Lai atrisinātu šo problēmu, Bāzeles profesorsBotonda Rossas universitāte un Pitsburgas universitātes profesors Žozē Sahels ir izveidojuši īpašas brilles, kas ienākošo attēlu pārveido smadzenēm saprotamā formātā un stimulē ganglija šūnas ar lāzera zibspuldzēm. Tā rezultātā pacients var redzēt lielu priekšmetu un priekšmetu siluetus un veikt citas sarežģītas darbības.
Lasīt vairāk:
Zinātnieki panspermijas teoriju ir pārbaudījuši uz tardigrādēm: viņi var ceļot kosmosā
Zinātnieki ir atklājuši, ka īpaši bagātināts zelts tiek veidots kā jogurts
Tiny ūdeņraža dzinējs aizstāj fosilo degvielu