Dmitry Madera - hoofd van de afdeling moleculaire genetica bij BIOCAD, hoofddocent bij SPUFU, Ph.D.
In 2002 studeerde hij af aan de faculteit Biologie van de Staatsuniversiteit van Moskouhoofdvak genetica. Hij verdedigde zijn proefschrift voor de graad van Doctor of Phylosophy in Biology op het programma voor de studie van functie en genexpressie aan de Universiteit van Massachusetts, waarna hij werkte aan de National Institutes of Health, de moleculaire aspecten van de ontwikkeling van kanker bestudeerde en hoe deze te beïnvloeden. In 2015 leidde hij het moleculaire genetica-laboratorium bij BIOCAD en ontwikkelt sindsdien producten voor gentherapie. De auteur van een internationaal patent dat een nieuw nuclease van de Cas9-familie beschrijft en artikelen op het gebied van kankerontwikkeling.
Hij Jiankui-experiment, oncologierisico bij geboren meisjes en doelmutaties
— Wat vind je van het experiment van de Chinese biofysicus He Jiankui, die het genoom van twee embryo’s bewerkte? Expertsvorderingdat geboren meisjes mutaties kunnen hebben. Hoe dit te voorkomen?— Na bestudering van de oorspronkelijke bron (MIT-onderzoek —"High-tech") en het commentaar van geneticus Fyodor Urnov, realiseerde ik me dat de media de informatie een beetje verdraaien. Ja, meisjes hebben een grotere kans op mutaties. Hiermee worden mutaties bedoeld waarvan niet bekend is waar ze precies zullen voorkomen. En nu is het lastig vast te stellen waar willekeurige mutaties precies zijn ontstaan onder invloed van CRISPR/Cas9. Om dit te doen, moet je een vergelijking maken met de ouders van de meisjes.
Formeel is dit de juiste verklaring:Oftarget-mutaties kunnen inderdaad bestaan. En je kunt er niets aan doen. En moderne methoden voor het bewerken van genen kunnen dit niet voorkomen. Dit is eigenlijk het probleem, omdat het gevaarlijk kan zijn.
Eind 2018, Chinese wetenschapper He Jiankuikondigde aan dat hij genetisch gemodificeerde tweelingmeisjes met aangeboren immuniteit voor hiv kon maken. Hij zei dat hij de embryo's van paren die IVF ondergingen, had bewerkt, en een van de zeven pogingen was succesvol. Het experiment leidde tot een nieuwe golf van discussies over de ethiek van het interfereren met de menselijke genetische code.
Fedor Urnov, bewerkingsspecialistHet genoom van de Universiteit van Californië merkte in een interview met MIT Technology Review op: "De claim dat het de geldende CCR5 reproduceerde is een flagrante verkeerde voorstelling van zaken" en voegde eraan toe dat het alleen kan worden omschreven als "opzettelijke verkeerde voorstelling van zaken."
Een nieuwe studie van MIT heeft aangetoond dat wetenschappers dat niet doenwaren in staat om de geldende versie van CCR5 te reproduceren. Hoewel het team op het juiste gen mikte, hebben de onderzoekers niet de gewenste variatie van de Delta 32 gekopieerd, maar in plaats daarvan nieuwe edities gemaakt, waarvan het effect niet duidelijk is - terwijl ze mutaties kunnen veroorzaken.
Beweren dat He Jiankui niet kon muterenhet CCR5-gen (het gen dat ervoor zorgt dat HIV menselijke cellen kan infecteren - Hi-Tech) is onjuist. Het heeft zijn doel daadwerkelijk bereikt en CCR5 is inderdaad gemuteerd en werkt niet meer, wat betekent dat HIV geen cellen kan infecteren. Ja, hij was blijkbaar niet in staat een specifiek natuurlijk allel te reproduceren dat in menselijke populaties wordt aangetroffen, maar niettemin is CCR5 “uitgeschakeld” en werkt het niet, wat betekent dat Jiankui het minimale doel heeft bereikt.
Om doelmutaties te voorkomen,het is noodzakelijk om methoden voor het bewerken van het genoom te verbeteren, om hun nauwkeurigheid te vergroten. Zo zal het in de toekomst mogelijk zijn om het risico op mutaties tot het achtergrondniveau te verminderen en vervolgens te kalmeren dat mutaties van nature voorkomen. Zoals ze zeggen, is het niet nodig om heiliger te zijn dan de paus.
- Dat wil zeggen, wanneer deze meisjes opgroeien, is het onrealistisch om precies te begrijpen welke mutaties ze hadden als gevolg van de acties van Jiankui?
- Specifiek gesproken over CCR5, en dan natuurlijkhet is mogelijk. En voor het hele genoom - in principe is het nu mogelijk, als je het genetische materiaal van hun vader en moeder neemt en het vergelijkt met het hunne. Dan zal duidelijk worden welke ouders opties hebben, en welke van degenen die aanwezig zijn in het genoom van de meisjes, noch moeder noch vader hebben. Een ander ding is dat het onmogelijk zal zijn om erachter te komen welke mutaties zijn ontstaan als gevolg van CRISPR / Cas en welke willekeurig. Je kunt alleen de frequentie van deze mutaties vergelijken: hoeveel normale mutaties treden op bij de geboorte en hoeveel van deze meisjes hebben ze. Als er een orde van grootte meer komt, dan is alles duidelijk.
CRISPR/Cas9-technologie voor genoombewerking heeft het potentieel om duizenden erfelijke ziekten uit te roeien die voorheen als ongeneeslijk werden beschouwd.
Het belangrijkste verschil tussen een gen-toolCRISPR / Cas9 bewerken vanuit andere, lang genoeg bestaande methoden - dit is de mogelijkheid van directionele DNA-veranderingen. Met CRISPR / Cas9 kunt u specifiek de DNA-sequentie beïnvloeden en zelfs het gebroken gen in het juiste veranderen. Om dit te doen, introduceert een speciaal enzym, nuclease, een opening op de juiste plaats in het genoom, waarna het reparatiesysteem wordt ingeschakeld - de interne mechanismen van de cel om het genoom te herstellen. In dit geval wordt DNA in de regel gerepareerd op de plaats van de breuk met willekeurige fouten, die hoogstwaarschijnlijk zal leiden tot het verlies of het invoegen van verschillende letters in de reeks en het verschijnen van mutaties. Daarom zoekt ze als een monster naar de gewenste volgorde in naburige genomen. Volgens technologie moet de cel deze sequentie vinden in speciale DNA-fragmenten. Hun genetica wordt in de cel geïntroduceerd om het te nemen en onafhankelijk in zichzelf te introduceren. Willekeurige mutaties op de breekplaats komen echter veel vaker voor dan gerichte reparatie volgens het monster.
Nog een vraag, Konstantin Severinov (Russischeen specialist op het gebied van moleculaire biologie en CRISPR/Cas - Hi-Tech) heeft ooit een interessant idee geuit dat als er iets heel verschrikkelijks zou zijn, de meisjes het eenvoudigweg niet zouden hebben overleefd, zelfs niet in het stadium van de embryogenese. Hoogstwaarschijnlijk werd niets fundamenteels aan hun genoom aangetast. Het enige waar ik bang voor ben is oncologie. Ik hoop echt dat ze geen vergelijkbare ziekten zullen krijgen.
- waarom? Wordt oncologie waarschijnlijker als gevolg van het bewerken van het menselijk genoom?
- Zeker. Laten we eens kijken naar de oorzaken van kanker.Er zijn er drie: erfelijke mutaties, dat wil zeggen speciale allelen die de kans op een verhoogd risico op kanker met zich meebrengen, zoals Angelina Jolie; virale oorzaken - bijvoorbeeld het humaan papillomavirus; en willekeurige mutaties. Juist het voorkomen van mutaties van dit laatste type bij de meisjes uit het Chinese experiment vrees ik, vooral als daar sprake was van een hoge frequentie van mutaties. Dan is de kans op het optreden van tumoren van welk type dan ook anders dan nul.
Dmitri Madera. Foto: Science Bar Hopping
Hoe het menselijk genoom, toonaangevende landen en het lot van de Russische genetica te bewerken
- Hoeveel gemakkelijker is het om dergelijke experimenten met dieren uit te voeren?
— Om het genoom van elk dier te bewerkenje hebt je eigen protocol nodig. Je moet een muis of een koe bewerken met behulp van verschillende protocollen. En de mens heeft, net als elk ander dier, de ontwikkeling ervan voor zichzelf nodig om zijn genoom zo effectief mogelijk te kunnen bewerken. Daarom kan niet worden gezegd dat het moeilijker is om een persoon te bewerken dan een koe. Je moet het alleen anders doen dan met een muis of rat. Maar de benaderingen blijven hetzelfde. Er is niets heel anders aan ons.
- Dat ishet probleem ligt alleen op het gebied van ethiek en wetten? En als er besloten zou worden, zouden er dan meer experimenten zijn?
- Ongetwijfeld.En dan zijn er eigenlijk best veel experimenten. Ik ga naar conferenties en ontmoet vaak collega's. De Universiteit van Oregon voert bijvoorbeeld uitstekende experimenten uit met het bewerken van het menselijk genoom en het kweken van embryo's. Ze worden vervolgens eenvoudigweg in een bepaald, vroeg stadium vernietigd. Dergelijke experimenten zijn niet verboden. In feite is de enige beperking de implantatie van een embryo en de cultivering ervan tot aan de geboorte.
- Welke landen zijn vandaag koplopers in onderzoek naar het bewerken van het menselijk genoom?
– Er zijn nu twee van zulke leiders, tussen hen en iedereende rest is een absolute afgrond. Dit zijn de VS en China. Niemand is zelfs dichterbij, ze zijn in hun onderzoek zo ver verwijderd van de rest van de wereld.
- Is het verbonden met financiering of wetenschappelijke basis?
- Met beide.China investeert veel geld in onderzoek, hun regering maakt zich daar grote zorgen over. En waar ze vroeger simpelweg technologie kopieerden, doen Chinese wetenschappers nu interessante dingen. En in de VS is er simpelweg een zeer sterke wetenschappelijke basis. Waar zijn al deze CRISPR/Cas eigenlijk ontdekt?De meeste ontdekkers van deze methode, behalve Jennifer Doudna, zijn Chinees, maar werken in de VS. Daarom was er zo'n synergie tussen de twee landen.
– Wat weerhoudt Rusland ervan zich op dit gebied te ontwikkelen? Zelfs de presidenthij verklaardeover de prioriteit van onderzoek in de richting van de genetica.
- Ik zal dit zeggen, vandaag is er al financieringonderzoek - er wordt veel geld toegewezen. Maar dit gebeurt natuurlijk niet allemaal binnen een uur. We hebben een wetenschappelijke basis en een school nodig. In Rusland is alles wat betreft genetica triest na het lysenkoïsme. Vóór Lysenko was de Sovjet-school voor genetica een van de beste ter wereld. Vavilov ging naar Morgan (Thomas Morgan - een van de grondleggers van de genetica, de Nobelprijswinnaar - High Tech), en ze communiceerden onder gelijke voorwaarden. Na Lysenko werd alles op een barbaarse manier vernietigd. En sindsdien kunnen we niet meer herstellen. Ja, geld is erg belangrijk. Maar het is ook noodzakelijk dat de kinderen gaan studeren, zodat buitenlandse specialisten worden betrokken. En als er een school is, komt er genomische bewerking in Rusland.
- Hoe zal dit worden beïnvloed door recente aanbevelingen met betrekking tot communicatie tussen Russische en buitenlandse wetenschappers - om alle contacten te melden, praktisch te communiceren, zoals in de Sovjetunie?
- Dit is heel eng. Het ergste dat kan worden gedaan voor de Russische wetenschap en het volledig te doden zijn deze aanbevelingen. En ik begrijp dat dit slechts aanbevelingen zijn en niet hoeven te worden gevolgd. Maar mensen, weet je, zijn bang. En ze beginnen ze proactief uit te voeren. Vooral geen wetenschappers, maar bureaucraten uit de wetenschap. Ze zullen stoppen met communiceren met buitenlandse wetenschappers. Ik ken het verhaal toen wetenschappelijke echtgenoten uit Duitsland enige tijd naar een conferentie in Rusland kwamen en buitenlandse wetenschappers niet vaak naar ons kwamen en vanwege deze vereisten niet in het evenement mochten komen. De wetenschap is internationaal en je moet zoveel mogelijk communiceren en communiceren met collega's, en dan is het goed. Ik veroordeel deze vereisten ten zeerste.
Behandeling van doofheid, gevaarlijke ziekten en medicijnafgifte
– Russische geneticus Denis Rebrikovgaan naarhet genoom van embryo’s bewerken voor paren met gehoorproblemen. Hoe waarschijnlijk is het succes van een dergelijk experiment?
— Denis Vladimirovich hield rekening met al zijn foutenChinese collega. Hij gaat het hele genoom sequencen. En het experiment zelf zal plaatsvinden in een meer gecontroleerde omgeving, niet in semi-ondergrondse omstandigheden, zoals het geval was bij Jiankui. Ik denk dat succes in principe vanuit methodologisch oogpunt mogelijk is, en het blijkt dat alles niet zo eng is, vooral niet als je moderne methoden gebruikt. En het mutatieniveau kan zich op het achtergrondniveau bevinden. Wat deze zieke kinderen betreft, ja, dit is een monogene mutatie, en het is dominant, dat wil zeggen, het is vrij gemakkelijk te vernietigen, wat genetici al goed doen. En dat is het eigenlijk, niets staat verder nog in de weg.
– Hoe past dit in de Russische wetgeving?
- Wat betreft de wetgevende aspecten, Rebrikovhet werkt hier gewoon op. En in die zin is het heel interessant om te weten wat daar gebeurt. Ik zou heel graag willen dat hij erin slaagt deze wetgevende muur te doorbreken. Hoewel zijn voorbeeld en de ziekte die hij koos, naar de mening van veel van mijn collega's en de mijne, niet zo relevant zijn. Maar het veld opent enorm, dus laat het de eerste zijn en een goed resultaat laten zien. En verder zal het mogelijk zijn om het "repertoire" uit te breiden.
- Welke andere gevaarlijke ziekten kunnen worden behandeld met CRISPR / Cas?
— Natuurlijk is cystische fibrose een zeer ernstige aandoeningziekte. Bij de behandeling van Duchenne-spierdystrofie is het mogelijk om gene editing toe te passen, in ieder geval bij sommige patiënten die een mutatie hebben die daar min of meer geschikt voor is. Over het algemeen zijn er meer dan 10.000 monogene genetische ziekten, en hier is de vraag welke methode handiger en eenvoudiger is voor behandeling. Spinale musculaire atrofie mag bijvoorbeeld niet worden behandeld met editing, maar eenvoudigweg met genvervangingstherapie.
Cystische fibrose- systemische erfelijke ziekte,veroorzaakt door een mutatie in het gen voor de transmembraanregulator van cystische fibrose en gekenmerkt door schade aan de exocriene klieren en ernstige disfunctie van de ademhalingsorganen. Cystische fibrose is niet alleen van bijzonder belang vanwege de wijdverbreide prevalentie ervan, maar ook omdat het een van de eerste erfelijke ziekten was die werd behandeld. Cystic fibrosis werd voor het eerst erkend als een afzonderlijke entiteit door Dorothy Andersen in 1938.
Duchenne myodystrofie- veroorzaakt door verwijderingen of duplicaties van éénof meerdere exons of puntmutaties in het dystrofine-gen. De belangrijkste manifestatie is spierzwakte, moeite met bewegen vanaf de kindertijd, die in de loop van de tijd toeneemt. De dood treedt meestal op in het tweede of derde decennium van het leven. De gemiddelde duur ervan is 25 jaar, maar er zijn mensen die langer leven.
- Wanneer kunnen wetenschappers dit doen? Wat is het tijdsbereik?
- Kijk, de dieren worden al behandeld.Het is waar dat ze natuurlijk eerst ‘verminken’ (dat wil zeggen: ze maken modeldieren om ziekten te bestuderen), en dan behandelen ze. Maar dit alles komt alleen naar een bewuste kliniek, en het duurt in de regel 5 tot 15 jaar. En zoals ik het begrijp, zullen de eerste klinische onderzoeken, aangezien dit een compleet nieuwe aanpak is, erg lang duren. Dit betekent dat we vijftien tot twintig jaar zullen moeten wachten. Dan ziet het er zo uit: kom, laat de diagnose stellen en word direct behandeld.
Dmitry Madera. Foto: Science Bar Hopping
- Dat wil zeggen, we hebben het niet over het bewerken van het embryogenoom, maar over het behandelen van volwassenen?
— Beide benaderingen zullen mogelijk zijn.
- Laten we praten overgenbewerkingzonder dubbele breuk. Waarom konden wetenschappers dit niet eerder doen?
“Het punt is dat het helemaal niet gemakkelijk is.”Toen ik de Nature-publicatie voor het eerst las, dacht ik: “Oh, waarom heb ik daar niet aan gedacht?” Alle grappen terzijde: het was een hoop werk, want aanvankelijk bestond er een soortgelijk idee, maar toen wetenschappers het probeerden, slaagden ze er niet in. Toen begonnen ze de reverse transcriptase te veranderen, waardoor het feitelijk muteerde om het anders te laten werken. En al bij een bepaalde iteratie begon het te werken en begon het zoiets te produceren. Het was een proces dat veel tijd en geld vergde. Daarom ben ik niet verrast dat er tijd verstreek tussen de uitvinding van simpelweg CRISPR/Cas en de komst van de methode die gebruik maakt van reverse transcriptase. Omdat het niet triviaal is.
- Welke kansen ontstaan er dankzij deze nieuwe methode?
- De kansen zijn geweldig, want nuhet blijkt dat we, met minimale risico's van het optreden van offsetmutaties, heel specifiek elk gen, allel kunnen veranderen. Als we bijvoorbeeld een puntmutatie willen vaststellen, maken we een verwijdering of een complexe vervanging. Dit geeft ons grote kansen, omdat meestal een of twee mutaties of deleties die zich voordoen klein zijn en ze kunnen worden hersteld binnen 40-50 nucleotiden.
Er waren eigenlijk al eerder technologieën -nucleotide-editors die eenvoudigweg "A" hebben overgenomen en vervangen door "G" of "C" door "T". Zulke werken werden en ze worden nog steeds gebruikt, maar natuurlijk is alles daar niet eenvoudig, omdat het blijkt dat ze niet alleen DNA bewerken, maar ook RNA, en ze zeggen niet dat het erg groot is - ze bewerken niet precies één nucleotide en het hele "venster". Misschien zal dit zich later ook ontwikkelen tot praktisch gebruik. Maar tot nu toe zijn er veel problemen. Ik herinnerde me deze methode omdat het ook geen dubbelstrengige breuken inhoudt. En het ontstond iets eerder dan deze recente studies.
— Ingenieurs van MIT en Harvard UniversiteitengebruiktCRISPR om een medicijnafgiftesysteem te creëren dat deze medicijnen alleen op een specifiek moment vrijgeeft. Hoe gebeurt dit precies?
- Specifiek gesproken over deze methode, dan hetde essentie is dat DNA een polymeer is en Cas12a het snijdt, waardoor de polymeerstructuur wordt vernietigd. Als DNA in de hydrogel wordt opgenomen, worden vervolgens stoffen vrijgemaakt die eerder met DNA-strengen in de hydrogel waren gefixeerd. Dat wil zeggen, hier fungeert DNA eenvoudig als fysiek materiaal dat op een gecontroleerde manier kan worden afgebroken. Over het algemeen worden hydrogels gebruikt op wonden en andere verwondingen wanneer een geleidelijke afgifte van medicijnen daaruit noodzakelijk is.
CRISPR/Cas zou in principe iets kunnen opleverennoodzakelijk voor een positie in het genoom. Dat is alles wat hij kan doen. Maar het kan het medicijn niet in de cel afleveren. Het is dus niet helemaal correct om te praten over het gebruik ervan voor medicijnafgifte.
Maar om CRISPR / Cas als te leverenmedicijnen in de cel; leveringsmethoden zijn nodig. En ze bestaan - ze kunnen viraal en niet-viraal zijn. Virussen zijn natuurlijk in de loop van hun geschiedenis geëvolueerd om bepaald genetisch materiaal aan de cel te leveren. Ze vermenigvuldigen zich dus. En niet-virale methoden zijn gewoon chemische methoden, wanneer sommige dragers worden gemaakt die in zichzelf nucleïnezuurmoleculen bevatten, niet noodzakelijkerwijs DNA, het kan trouwens zelfs RNA of eiwit zijn. Meestal zijn het enkele druppeltjes vet die beschermen wat ze moeten leveren tegen nucleasen en proteasen, en antilichamen kunnen ook eraan worden gehangen om ze specificiteit voor een bepaalde cel te geven. En deze lipofiele complexen leveren medicijnen aan de cel. En er zijn werken die verband houden met complexe polymeren of gouden nanodeeltjes, die, net als een kanon, cellen verbranden, ze erin vliegen en hun inhoud afleveren, zoals een genomisch kanon.
- Is het mogelijk om iemands leven aanzienlijk te verlengen dankzij genbewerking? Hoeveel kan dit worden gedaan en welke ziekten moeten op deze manier worden genezen?
- Complex vraagstuk.Feit is dat er mutaties zijn die bij dieren een zekere verlenging van het leven veroorzaken, een vertraging van de veroudering. Ze worden meestal geassocieerd met het DNA-reparatiesysteem. In veel opzichten is veroudering een gevolg van de opeenstapeling van willekeurige fouten die leiden tot de activering van retrovirale elementen, en als gevolg daarvan wordt het genoom niet gereguleerd en begint het zijn gastheer tegen te werken. Er is een punt: we weten niet hoe het bij mensen zal werken. Helaas, en dit kwam als een grote verrassing, zijn de mechanismen van veroudering en bescherming ertegen zeer soortspecifiek. En voor mensen blijken dezelfde muizen niet helemaal een adequaat model te zijn. En hoe adequater het model is en hoe langer het leeft, hoe moeilijker het is om ermee te werken. Bijvoorbeeld dezelfde SIRT6 - bij langlevende soorten is het één, en bij kortlevende soorten is het anders, er is een duidelijke correlatie. Het leek erop dat SIRT6 van een olifant naar een persoon werd overgebracht. Of verschillende kopieën van menselijk SIRT6 (het gen dat codeert voor het sirtuin-6-eiwit helpt DNA-schade te corrigeren - dubbelstrengsbreuken en vervangingen in genetische nucleotideletters - Hi-Tech). Dit kan werken, maar misschien ook niet. Die mogelijkheid bestaat, en natuurlijk zou ik het proberen. Maar als we het hebben over het verlengen van het leven, dan moeten we hoogstwaarschijnlijk genen bewerken die verband houden met DNA-reparatie. Tegenwoordig is dit echter voor zo'n organisme als een persoon slechts een hypothese.