Dmitry Madera - leder for molekylærgenetisk avdeling ved BIOCAD, universitetslektor ved SPUFU, Ph.D.
I 2002 ble han uteksaminert fra Fakultet for biologi ved Moskva statsuniversitethovedfag i genetikk. Han disputerte for graden doktor i filosofi i biologi på programmet for studier av funksjon og genuttrykk ved University of Massachusetts, hvoretter han jobbet ved National Institutes of Health, studerte de molekylære aspektene ved utvikling av kreft og hvordan han kunne påvirke dem. I 2015 ledet han molekylærgenetikklaboratoriet ved BIOCAD, og har siden vært engasjert i utviklingen av genterapiprodukter. Forfatteren av et internasjonalt patent som beskriver en ny nuklease av Cas9-familien og artikler innen kreftutvikling.
Han Jiankui eksperiment, onkologisk risiko hos jenter født og målmutasjoner
— Hva synes du om eksperimentet til den kinesiske biofysikeren He Jiankui, som redigerte genomet til to embryoer? Eksperterkravat fødte jenter kan ha mutasjoner. Hvordan unngå dette?— Etter å ha studert den opprinnelige kilden (MIT-forskning —"High-tech") og kommentaren til genetikeren Fjodor Urnov, skjønte jeg at media forvrenger informasjonen litt. Ja, jenter har større sannsynlighet for å ha mutasjoner. Dette refererer til de mutasjonene som ikke er kjent hvor nøyaktig de vil oppstå. Og nå er det vanskelig å fastslå nøyaktig hvor tilfeldige mutasjoner oppsto som følge av påvirkningen av CRISPR/Cas9. For å gjøre dette, må du gjøre en sammenligning med jentenes foreldre.
Formelt sett er dette riktig utsagn:Ofte målmutasjoner kan faktisk eksistere. Og det er ingenting du kan gjøre med det. Og moderne genredigeringsmetoder forhindrer ikke dette. Dette er faktisk problemet, for det kan være farlig.
På slutten av 2018, den kinesiske forskeren He Jiankuikunngjorde at han var i stand til å skape genmodifiserte tvillingjenter med medfødt immunitet mot HIV. Han sa at han redigerte embryoene til par som gjennomgikk IVF, og ett av de syv forsøkene var vellykket. Eksperimentet utløste en ny bølge av diskusjoner om etikken i å forstyrre den menneskelige genetiske koden.
Imidlertid Fedor Urnov, redigeringsspesialistGenomet fra University of California bemerket i et intervju med MIT Technology Review: "Påstanden om at den reproduserte den rådende CCR5 er en åpenlyst uriktig fremstilling," og la til at den bare kan beskrives som "forsettlig feilrepresentasjon."
En ny studie fra MIT viste at forskere ikke gjør detkunne reprodusere den gjeldende versjonen av CCR5. Selv om teamet siktet seg mot riktig gen, kopierte ikke forskerne den ønskede variasjonen av Delta 32, men opprettet i stedet nye utgaver, hvis virkning ikke er tydelig - mens de kan forårsake mutasjoner.
Hevder at He Jiankui ikke var i stand til å mutereCCR5-genet (genet som lar HIV infisere menneskelige celler - Hi-Tech) er feil. Det nådde faktisk målet sitt, og CCR5 var faktisk mutert og fungerer ikke lenger, noe som betyr at HIV ikke kan infisere celler. Ja, han klarte tilsynelatende ikke å reprodusere et spesifikt naturlig allel som finnes i menneskelige populasjoner, men likevel er CCR5 "slått ut" og fungerer ikke, noe som betyr at Jiankui har oppnådd minimumsmålet.
For å forhindre mutasjonsmålinger,det er nødvendig å forbedre metoder for redigering av genomet, for å øke deres nøyaktighet. Dermed vil det i fremtiden være mulig å redusere risikoen for mutasjoner til bakgrunnsnivået, og deretter roe ned på det faktum at mutasjoner oppstår naturlig. Som de sier, det er ikke nødvendig å være helligere enn paven.
- Det vil si at når disse jentene blir store, vil det være urealistisk å forstå nøyaktig hvilke mutasjoner de hadde som et resultat av handlingene til Jiankui?
- Å snakke spesifikt om CCR5, da, selvfølgelig,det er mulig. Og for hele genomet - i prinsippet er det mulig nå, hvis du tar arvestoffet til faren deres og moren og sammenligner det med deres eget. Da vil det bli klart hvilke foreldre som har alternativer, og hvilke av de som er til stede i jentenes genom, verken mamma eller pappa har. En annen ting er at det vil være umulig å finne ut hvilke mutasjoner som oppsto som et resultat av CRISPR / Cas, og hvilke tilfeldig. Du kan bare sammenligne hyppigheten av disse mutasjonene: hvor mange normale mutasjoner som oppstår ved fødselen og hvor mange av disse jentene. Hvis det kommer en størrelsesorden mer, er alt klart.
CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi har potensial til å utrydde tusenvis av arvelige sykdommer som tidligere ble ansett som uhelbredelige.
Hovedforskjellen mellom et genverktøyredigering av CRISPR / Cas9 fra andre, lange nok eksisterende metoder - dette er muligheten for retningsbestemt DNA-endringer. CRISPR / Cas9 lar deg spesifikt påvirke DNA-sekvensen og til og med endre det ødelagte genet til riktig. For å gjøre dette introduserer et spesielt enzym, nuklease, et gap på rett sted i genomet, hvoretter reparasjonssystemet aktiveres - de indre mekanismene i cellen for å gjenopprette genomet. I dette tilfellet blir DNA reparert på stedet for bruddet, som regel, med tilfeldige feil, noe som mest sannsynlig vil føre til tap eller innsetting av flere bokstaver i sekvensen og utseendet til mutasjoner. Derfor søker hun som prøve for ønsket sekvens i nabomomen. I følge teknologi må cellen finne denne sekvensen i spesielle DNA-fragmenter. Genetikken deres ble introdusert i cellen for å ta den og uavhengig introdusere den i seg selv. Tilfeldige mutasjoner på bruddstedet forekommer imidlertid mye oftere enn rettet reparasjon langs prøven.
Et annet spørsmål, Konstantin Severinov (russisken spesialist innen molekylærbiologi og CRISPR/Cas - Hi-Tech) uttrykte en gang en interessant idé om at hvis det var noe helt forferdelig der, ville jentene rett og slett ikke ha overlevd selv på embryogenesestadiet. Mest sannsynlig ble ingenting grunnleggende om genomet deres påvirket. Det eneste som skremmer meg er onkologi. Jeg håper virkelig at de ikke får lignende sykdommer.
- Hvorfor? Blir onkologi mer sannsynlig som et resultat av redigering av det menneskelige genomet?
- Absolutt. La oss ta en titt på årsakene til kreft.Det er tre av dem: arvelige mutasjoner, det vil si spesielle alleler som bærer sannsynligheten for å øke risikoen for kreft, som Angelina Jolie; virale årsaker - humant papillomavirus, for eksempel; og tilfeldige mutasjoner. Det er nettopp forekomsten av mutasjoner av sistnevnte type hos jentene fra det kinesiske eksperimentet jeg frykter, spesielt hvis det var høy frekvens av mutasjoner der. Da er sannsynligheten for forekomsten av svulster av enhver type forskjellig fra null.
Dmitry Madera. Foto: Science Bar Hopping
Hvordan redigere menneskets genom, ledende land og skjebnen til russisk genetikk
- Hvor mye lettere er det å gjennomføre slike eksperimenter med dyr?
— Å redigere genomet til hvert dyrdu trenger din egen protokoll. Du må redigere en mus eller en ku ved å bruke forskjellige protokoller. Og mennesket, som et annet dyr, krever dets utvikling for seg selv for å kunne redigere genomet sitt mest effektivt. Derfor kan det ikke sies at det er vanskeligere å redigere en person enn en ku. Du trenger bare å gjøre det annerledes enn med en mus eller rotte. Men tilnærmingene forblir de samme. Det er ikke noe veldig annerledes med oss.
- Det erproblemet ligger bare innen etikk og lover? Og hvis det ble bestemt, ville det være flere eksperimenter?
- Utvilsomt.Og så er det faktisk ganske mange eksperimenter. Jeg går på konferanser og møter ofte kollegaer. For eksempel gjennomfører University of Oregon utmerkede eksperimenter med å redigere det menneskelige genomet og dyrke embryoer. De blir ganske enkelt deretter ødelagt på et visst, tidlig stadium. Slike eksperimenter er ikke forbudt. Faktisk er den eneste begrensningen implantasjonen av et embryo og dets dyrking frem til fødselen.
- Hvilke land er ledende innen forskning på redigering av det menneskelige genom i dag?
— Det er to slike ledere nå, mellom dem og alleresten er en absolutt avgrunn. Dette er USA og Kina. Ingen er enda nærmere, de er så langt unna resten av verden i sin forskning.
- Har det sammenheng med finansiering eller vitenskapelig grunnlag?
- Med begge.Kina investerer mye penger i forskning, deres regjering er veldig bekymret for dette. Og hvis de tidligere bare kopierte teknologi, nå gjør kinesiske forskere interessante ting. Og i USA er det rett og slett et veldig sterkt vitenskapelig grunnlag. Faktisk, hvor ble alle disse CRISPR/Cas oppdaget? De fleste av oppdagerne av denne metoden, bortsett fra Jennifer Doudna, er kinesere, men de jobber i USA. Derfor var det en slik synergi mellom de to landene.
— Hva hindrer Russland i å utvikle seg på dette området? Til og med presidentenhan uttalteom prioritering av forskning i retning av genetikk.
- Jeg vil si dette, i dag er det allerede finansieringforskning - mye penger blir bevilget. Men alt dette er selvfølgelig ikke gjort på en time. Vi trenger en vitenskapelig base og skole. I Russland, med tanke på genetikk, er alt trist etter Lysenkoisme. Før Lysenko var den sovjetiske skolen for genetikk en av de beste i verden. Vavilov gikk til Morgan (Thomas Morgan - en av grunnleggerne av genetikk, nobelprisvinneren - “High Tech”), og de kommuniserte på like vilkår. Etter Lysenko ble alt ødelagt på en barbarisk måte. Og siden kan vi ikke komme oss. Ja, penger er veldig viktig. Men det er også nødvendig at barna går for å studere, slik at utenlandske spesialister blir involvert. Og hvis det er en skole, vil det være genomisk redigering i Russland.
- Hvordan vil dette bli påvirket av nylige anbefalinger om kommunikasjon mellom russiske og utenlandske forskere - for å rapportere alle kontakter, for praktisk kommunikasjon, som i Sovjetunionen?
- Dette er veldig skummelt. Det verste som kan gjøres for russisk vitenskap og drepe den fullstendig, er disse anbefalingene. Og jeg forstår at dette bare er anbefalinger, og de trenger ikke å følges. Men folk, du vet, er redde. Og de begynner å gjennomføre dem proaktivt. Spesielt ikke forskere, men byråkrater fra vitenskap. De vil begynne å slutte å kommunisere med utenlandske forskere. Jeg kjenner historien da stipendiater fra Tyskland ankom en slags konferanse i Russland for en tid tilbake, og utenlandske forskere kommer ikke ofte til oss og de fikk ikke lov til å delta på arrangementet på grunn av disse kravene. Vitenskap er internasjonal, og du trenger å kommunisere og samhandle med kollegene så mye som mulig, og da vil det være bra. Jeg fordømmer på det sterkeste disse kravene.
Behandling av døvhet, farlige sykdommer og medisinelevering
— Den russiske genetikeren Denis Rebrikovgår tilredigere genomet til embryoer for par med hørselshemninger. Hvor sannsynlig er suksessen til et slikt eksperiment?
— Denis Vladimirovich tok hensyn til alle sine feilkinesisk kollega. Han skal gjøre sekvensering av hele genomet. Og selve eksperimentet vil foregå i et mer kontrollert miljø, ikke i semi-underjordiske forhold, slik tilfellet var med Jiankui. Jeg tror at suksess i prinsippet, fra et metodisk synspunkt, er mulig, og det viser seg at alt ikke er så skummelt, spesielt når du bruker moderne metoder. Og mutasjonsnivået kan være på bakgrunnsnivå. Når det gjelder disse syke barna, ja, dette er en monogen mutasjon, og den er dominerende, det vil si at det er ganske lett å ødelegge den, som genetikere allerede gjør godt. Og, faktisk, det er det, ingenting står i veien videre.
— Hvordan passer dette inn i russisk lovverk?
- Når det gjelder lovgivningsaspektene, Rebrikovdet fungerer bare på dette. Og i denne forstand er det veldig interessant å vite hva som skjer der. Jeg vil virkelig at han skal lykkes med å bryte gjennom denne lovgivningsmuren. Selv om eksemplet hans og sykdommen som han valgte, etter mange av mine kolleger og min mening, ikke er så relevant. Men feltet åpner stort, så la det være det første og vise et godt resultat. Og videre vil det være mulig å utvide "repertoaret".
- Hvilke andre farlige sykdommer kan behandles med CRISPR / Cas?
— Selvfølgelig er cystisk fibrose en veldig alvorligsykdom. Det er mulig å bruke genredigering i behandlingen av Duchennes muskeldystrofi, i hvert fall hos noen pasienter som har en mutasjon som er mer eller mindre egnet for dette. Generelt er det mer enn 10 tusen monogene genetiske sykdommer. Og her er spørsmålet hvilken metode som er mer praktisk og enklere for behandling. Spinal muskelatrofi bør for eksempel ikke behandles med redigering, men ganske enkelt med generstatningsterapi.
Cystisk fibrose- systemisk arvelig sykdom,forårsaket av en mutasjon i genet for den transmembrane regulatoren av cystisk fibrose og preget av skade på de eksokrine kjertlene og alvorlig dysfunksjon i luftveiene. Cystisk fibrose er av spesiell interesse, ikke bare på grunn av dens utbredte utbredelse, men også fordi det var en av de første arvelige sykdommene som ble behandlet. Cystisk fibrose ble først anerkjent som en distinkt enhet av Dorothy Andersen i 1938.
Duchenne myodystrofi- forårsaket av slettinger eller dupliseringer av eneller flere eksoner eller punktmutasjoner i dystrofingenet. Den viktigste manifestasjonen er muskelsvakhet, problemer med å bevege seg fra barndommen, som utvikler seg over tid. Døden inntreffer vanligvis i det andre eller tredje tiåret av livet. Dens gjennomsnittlige varighet er 25 år, men det er mennesker som lever lenger.
- Når vil forskere kunne gjøre dette? Hva er tidsområdet?
– Se, dyrene er allerede under behandling.Det er sant, først "lemlester de", selvfølgelig (det vil si at de lager modelldyr for å studere sykdommer), og deretter behandler de. Men alt dette kommer bare til en bevisst klinikk, og det varer som regel fra 5 til 15 år. Og slik jeg forstår det, siden dette er en helt ny tilnærming, vil de første kliniske studiene ta veldig lang tid. Det betyr at vi må vente 15–20 år. Da vil det se slik ut: kom, få diagnosen og behandlet umiddelbart.
Dmitry Madera. Foto: Science Bar Hopping
- Det vil si at det ikke handler om å redigere genomet til embryoene, men om behandling av voksne?
— Begge tilnærmingene vil være mulige.
- La oss snakke omgenredigeringuten dobbelt brudd. Hvorfor kunne ikke forskere gjøre det før?
– Saken er at det ikke er lett i det hele tatt.Da jeg leste Nature-publikasjonen for første gang, tenkte jeg: "Åh, hvordan tenkte jeg ikke på det?" Bortsett fra vitser, var det mye arbeid, for i utgangspunktet var det en lignende idé, men da forskere prøvde den, lyktes de ikke. Så begynte de å endre revers transkriptasen, og muterte den i hovedsak for å få den til å fungere annerledes. Og allerede ved en viss iterasjon begynte det å virke og begynte å produsere noe sånt. Det var en prosess som krevde mye tid og finansiering. Derfor er jeg ikke overrasket over at tiden gikk mellom oppfinnelsen av ganske enkelt CRISPR/Cas og fremkomsten av metoden som bruker revers transkriptase. Fordi det er ikke-trivielt.
- Hvilke muligheter åpner seg takket være denne nye metoden?
- Mulighetene er store, for nådet viser seg at vi, med minimal risiko for forekomst av målmutasjoner, veldig spesifikt kan endre ethvert gen, allel. Hvis vi for eksempel vil etablere en punktmutasjon, oppretter du en sletting eller en kompleks erstatning. Dette gir oss store muligheter, fordi vanligvis stort sett en eller to mutasjoner eller slettinger som oppstår er små, og de kan gjenopprettes innen 40-50 nukleotider.
Faktisk var det teknologier litt tidligere -nukleotidredaktører som bare tok og erstattet for eksempel “A” med “G” eller “C” med “T”. Slike arbeider var og de brukes fremdeles, men alt er selvfølgelig ikke enkelt der, for det viser seg at de redigerer ikke bare DNA, men også RNA, og de sier ikke at de er veldig nøyaktige - de redigerer ikke nøyaktig ett nukleotid, og hele "vinduet". Kanskje dette også senere vil utvikle seg til praktisk bruk. Men foreløpig er det mange problemer. Jeg husket denne metoden fordi den heller ikke involverer dobbeltstrengede pauser. Og det oppsto litt tidligere enn disse nyere studiene.
— Ingeniører fra MIT og Harvard UniversiteterbruktCRISPR for å lage et medikamentleveringssystem som frigjør dem bare på et bestemt tidspunkt. Hvordan skjer dette?
- Å snakke spesifikt om denne metoden, så detessensen er at DNA er en polymer, og Cas12a kutter den og derved ødelegger polymerstrukturen. Hvis DNA innarbeides i hydrogelen, frigjøres stoffer som tidligere var fikset i hydrogelen med DNA-tråder, fra den. Det vil si at her fungerer DNA ganske enkelt som fysisk materiale som kan spaltes på en kontrollert måte. Generelt brukes hydrogeler på sår og andre skader når en gradvis frigjøring av medikamenter fra dem er nødvendig.
I prinsippet kunne CRISPR/Cas levere noenødvendig for en posisjon i genomet. Det er alt han kan gjøre. Men den kan ikke levere medisinen inn i cellen. Så det er ikke helt riktig å snakke om bruken av det til medikamentlevering.
Men å levere CRISPR / Cas asmedisiner i cellen; leveringsmetoder er nødvendig. Og de eksisterer - de kan være virale og ikke-virale. Virus har selvfølgelig utviklet seg gjennom historien sin for å levere visse genetiske materialer til cellen. De formerer seg slik. Og ikke-virale metoder er ganske enkelt kjemiske metoder, når noen bærere lages som inneholder inni seg nukleinsyremolekyler, ikke nødvendigvis DNA, forresten, det kan til og med være RNA eller protein. Vanligvis er de noen dråper fett som beskytter det de trenger for å levere fra nukleaser og proteaser, og antistoffer kan også henges på dem for å gi dem spesifisitet for en bestemt celle. Og disse lipofile kompleksene leverer medisiner til cellen. Og det er arbeider relatert til komplekse polymerer eller nanopartikler i gull, som, som en kanon, svidd celler, de flyr inn i dem og leverer innholdet, for eksempel en genomisk kanon.
- Er det mulig å forlenge en persons liv betydelig takket være genredigering? Hvor mye kan dette gjøres, og hvilke sykdommer må kureres på denne måten?
- Kompleks problemstilling.Faktum er at det er mutasjoner som hos dyr forårsaker en viss forlengelse av livet, en nedgang i aldring. De er vanligvis assosiert med DNA-reparasjonssystemet. På mange måter er aldring en konsekvens av akkumulering av tilfeldige feil som fører til aktivering av retrovirale elementer, og som et resultat blir genomet ikke regulert og begynner å virke mot verten. Det er et poeng her, vi vet ikke hvordan det vil fungere hos folk. Dessverre, og dette kom som en stor overraskelse, er mekanismene for aldring og beskyttelse mot det veldig artsspesifikke. Og for mennesker viser de samme musene seg å ikke være en helt adekvat modell. Og jo mer adekvat modellen er og jo lenger den lever, jo vanskeligere er det å jobbe med den. For eksempel samme SIRT6 - hos langlivede arter er det en, og i kortlivede arter er det forskjellig, det er en klar sammenheng. Det virket som å ta og sette inn SIRT6 fra en elefant til en person. Eller flere kopier av menneskelig SIRT6 (genet som koder for sirtuin-6-proteinet hjelper til med å korrigere DNA-skader - dobbelttrådbrudd og substitusjoner i genetiske nukleotidbokstaver - Hi-Tech). Dette kan fungere, eller det kan ikke. Det er en slik mulighet, og selvfølgelig ville jeg prøvd. Men hvis vi snakker om å forlenge livet, trenger vi mest sannsynlig å redigere gener knyttet til DNA-reparasjon. I dag, men for en slik organisme som person, er dette bare en hypotese.