Skoltechs massespektrometrilaboratorium ledes av et tilsvarende medlem av det russiske vitenskapsakademiet
Det som ligger i hjertet av å bygge livsprosesser
DNA er en lang polymerkjede som lagrer informasjon om hvordan kroppen skal se ut og fungere.Det vil si hvordan vi skiller oss fra andre arterog hvordan to individer av samme art skiller seg fra hverandre. Disse molekylene bestemmer vår egenart. La meg gi deg et eksempel: en larve og sommerfuglen som den vokser inn i. Tror du deres DNA-molekyler er forskjellige eller like? Faktisk er det riktige svaret: det samme. Genetisk informasjon endres ikke på noen måte i løpet av livet. Egentlig, hvorfor er larver og sommerfugler forskjellige til slutt? For ikke all informasjon som er lagret i DNA, realiseres samtidig. Implementering skjer gjennom prosessen med transkripsjon, som et resultat av at messenger-RNA, etter å ha lest individuelle gener, tillater syntese av proteiner.
Proteiner er universelle molekylære maskiner i kroppen vår som utfører forskjellige funksjoner: fra konstruksjon til regulatorisk.En av de utdaterte definisjonene av liv erordnet eksistens og interaksjon av proteinmolekyler. Men problemet er at proteinmolekylene også er store. Proteiner er også polymermolekyler med stor molekylvekt: vanligvis fra 10 til flere hundre kilodalton. Og å bygge grunnleggende livsprosesser på dem er ganske problematisk, fordi de er ganske følsomme for endringer i temperatur og det ytre miljøet. Og dette er sannsynligvis grunnen til at nesten alle vitale prosesser i en celle realiseres gjennom små molekyler. Og transformasjonen av små molekyler til hverandre er allerede kontrollert av proteiner. Molekylvekten til disse små molekylene er fra flere titalls til flere hundre kilodalton. Alle små molekyler som finnes i en levende organisme kalles metabolitter.
1 dalton, eller 1 atommasseenhet (amu)- en ekstrasystemenhet av masse som brukes for massene av molekyler, atomer, atomkjerner og elementærpartikler.
1 a. enheter = 1.660 539066 60 (50) ⋅10−27 kg.
Primære metabolitter er kjemikalier som finnes i alle celler i kroppen og er nødvendige for å opprettholde vitale prosesser.Alle polymermolekyler, proteiner ognukleinsyrer. Disse metabolittene er de samme for alle cellene i en organisme. I løpet av livet omdannes metabolitter til hverandre, for eksempel for energioverføring. Og disse transformasjonsveiene - transformasjonskjeder - kalles metabolske veier.
Krebs-syklusen, eller trikarboksylsyresyklusen, er ansvarlig for prosessen med cellulær respirasjon.
Ulike metabolske veier i menneskekroppen krysser seg, det vil si at de har vanlige deltakere.Dermed er alle prosesser som skjer med metabolitter sammenkoblet.
Sekundære metabolitter er stoffer som ikke er nødvendige for alle celler for å sikre deres vitale funksjoner.De brukes vanligvis for å tilpasse seg forholdeneeksternt miljø. For eksempel produserer kaffeplanter koffein for å beskytte bladene mot skadedyr. De er giftige for biller som spiser bladene til kaffeplanter. Men hvis vi på en eller annen måte fjerner all koffein fra planten, vil den fortsette å leve. Ingen vitale prosesser vil bli forstyrret. Det andre eksemplet er antibiotika. Du vet at penicillin er det første antibiotikumet, og det ble helt ved et uhell isolert fra muggsopp, noe som revolusjonerte medisinen. Muggsopp bruker penicillin for å rydde oppholdsrommet. Det er ufarlig for foreldreorganismen, men giftig for andre mikroorganismer. Faktisk bruker folk denne egenskapen til å behandle ulike bakterielle infeksjoner. På grunn av det faktum at mennesker aktivt konsumerer planter som mat, er kroppen vår tett befolket med forskjellige mikroorganismer som danner mikroflora. Disse stoffene er sekundære metabolitter, ikke bare av personen selv, men også av levende organismer som uunngåelig kommer inn i kroppen vår.
Det naturlige filteret og hvorfor det er galt
Xenometabolitter er antibiotika, forbindelser som ikke er assosiert med aktiviteten til levende organismer.Det er vanligvis noe som en person har mottattkunstig til forskjellige formål. For eksempel medisiner, mattilsetningsstoffer, kosttilskudd, doping, narkotika, forbrenningsprodukter av tobakk, alkohol eller hygieneprodukter, husholdningskjemikalier, økotoksiske stoffer. Dette er også små molekyler, og de kommer inn i kroppen både med vilje, når det gjelder narkotika, og ved et uhell. Du pusset for eksempel tennene, svelget tannkrem – og slik kom nye kjemikalier inn i systemet ditt. Og mange av disse stoffene kan ha visse effekter på kroppen vår, selv i svært små konsentrasjoner. Dessuten kan denne effekten enten være positiv eller negativ eller variere avhengig av mengden av dette stoffet.
Leveren er den første barrieren mot innføring av fremmede kjemikalier i den systemiske sirkulasjonen.Den prøver å filtrere ut molekyler somkroppen vil bli skadet og fjerne dem, og hindre dem fra å slippes videre gjennom blodet inn i organene. Leveren har mange filtreringsmekanismer, men ingen av dem fungerer 100%: ellers ville det ikke være noen forgiftning og alvorlige konsekvenser av å ta giftstoffer eller medikamenter. Men leveren utnytter det faktum at kroppen vår i stor grad er vann, det vil si at den består av 80 prosent vann. Derfor prøver leveren å sortere molekylene i hydrofile, som løses opp i vann, og hydrofobe. Leveren "tror" at hvis stoffet er hydrofilt, kan det frigjøres ytterligere i den systemiske sirkulasjonen, siden det ikke skal forårsake mye skade. Og hvis stoffet er hydrofobt, så må det gjøres noe med det for å hindre at det frigjøres videre eller i det minste gjøre det mer hydrofilt.
Leveren har to mekanismer - metabolske faser.I den første fasen prøver leveren åspesielle proteiner og enzymer fra cytokrom P450-familien oksiderer disse stoffene. Som et resultat av oksidasjon endres strukturen til molekylet og det kan bli mer hydrofilt. Leveren kan deretter frigjøre disse metabolittene i blodet eller prøve å fjerne dem gjennom nyrene gjennom urin eller gjennom tarmen. Hvis dette ikke fungerer, kan leveren "sy" ferdige, garantert vannløselige molekyler på disse oksiderte molekylene.
Leverstoffskiftet øker mangfoldet av små molekyler som kan havne i kroppene våre.For eksempel, på oksidasjonsstadiet, blir mer enn 500 forskjellige nye andre molekyler teoretisk dannet fra ett molekyl, det er ikke mulig å forutsi hvilke av dem som dannes og hvilke som ikke er det.
Det uendelige alfabetet: hvorfor det er så vanskelig å studere metabolitter
Nukleinsyrer kan representeres som et alfabet med fem bokstaver som en stor tekststreng er konstruert av.Ja, selvfølgelig, rekkefølgen av bokstaver i dettelinje kan være relativt kaotisk, selv om DNA ikke endres i løpet av livet, men bare kopieres. Så vi har visse begrensninger på hva denne strengen vil være. Når det gjelder proteiner er situasjonen noe mer komplisert: det vil allerede være 20 bokstaver i alfabetet, det vil si 20 aminosyrer som proteiner er bygget opp fra, men dette skjer også ufrivillig. Derfor, fra forskerens synspunkt, er disse objektene også ganske like hverandre. Og når det gjelder metabolitter, er det ekstremt problematisk å skille ut et hvilket som helst alfabet: faktisk er dette hele det periodiske systemet. Og blant reglene for dannelse - bare valensregelen. I tillegg er det et trekk ved karbonkjemi som lar to karbonatomer binde seg til hverandre og deretter legge til et ubegrenset antall karbonatomer eller andre atomer fra det periodiske systemet, noe som gir opphav til et enormt kjemisk mangfold av slike molekyler.
For å studere slike små molekyler og all deres variasjon kreves det spesielle metoder.Det er enkle:for eksempel en organoleptisk analyse, som alle som har tatt en generell blod- eller urinprøve og så at det er en linje "lukt, farge" i retningen har møtt. Når det er nødvendig å finne et spesifikt molekyl i en løsning, tilsettes en dråpe av et forhåndsvalgt reagens. Hvis det var et molekyl i løsningen, vil det oppstå farging hvis det ikke var det, vil bare et bunnfall vises. Blant de enkle metodene er det også optisk spektroskopi, når du kan bruke et mikroskop til å trekke konklusjoner fra strukturen til sedimentet. Ganske populære nå er immunkjemiske metoder: dette er den samme ELISA-testen for COVID-19.
Omics-studier er de studiene som studerer en komplett populasjon.Og metabolomics innebærer analyse av storedata som representerer hele settet med små molekyler i en organisme, celle eller organ. Settet med disse dataene varierer i henhold til forskjellige estimater fra flere tusen, hvis vi bare betrakter primære metabolitter, til flere titusener, hvis vi legger til sekundære metabolitter av kjente planter, bakterier og sopp til dem. Faktisk opptil flere hundre millioner, hvis vi tar hensyn til alt kjemisk mangfold som kan komme inn i menneskekroppen. Og for å studere dem er det behov for spesielle metoder: kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og massespektrometri.
I løpet av den 80 år lange historien til NMR har forskere som er involvert i denne metoden mottatt fem nobelpriser.Fire - for NMR, og den femte - formagnetisk resonansavbildning. En metode som er litt forskjellig fra NMR-spektroskopi, men veldig lik i prinsippet. NMR-metoden er basert på at noen atomer i det periodiske systemet har et magnetisk moment som ikke er null. De er små magneter og kan samhandle med et eksternt magnetfelt. Denne interaksjonen manifesterer seg i splitting av energinivåer. NMR-metoden lar en skille mellom ulike atomer og atomer av samme grunnstoff, men i ulike miljøer. Nylig har NMR mistet popularitet, først og fremst på grunn av de høye kostnadene.
Hvordan lage ladede partikler fra en kompleks blanding og finne ut sammensetningen
Massespektrometri er en metode for å skille ladede partikler ved å samhandle med et elektromagnetisk felt.Hvis vi tar noen kompleks blanding bestående avforskjellige ladede partikler, og nesten ethvert molekyl med moderne massespektrometrimetoder kan konverteres til en ladet form ved å legge et proton til det eller fjerne et proton fra det, og påføre et elektromagnetisk felt på denne blandingen, så vil partiklene i dette feltet begynne å bevege seg og de vil ha enten hastighet, eller en bane avhengig av masse. Lette partikler vil ankomme detektoren tidligere enn tunge. Etter å ha behandlet dataene fra detektoren, oppnås et massespektrum, der langs Y-aksen vil det være signalintensitet, som er proporsjonal med antall ioner, og langs X-aksen - massen i ionene, eller rettere sagt, forholdet mellom masse og ladning. Dessuten lar massespektrometri deg måle masse med svært høy nøyaktighet. Dette betyr at det er mulig å entydig fastslå grunnstoffsammensetningen til ionet, ladede partiklene eller molekylet det ble dannet av. Matematisk kalles dette å løse den diofantiske ligningen i heltall: faktisk er dette et utvalg koeffisienter nær hvert atom: m(C), m(H), k(O), z(N). Og bare én kombinasjon av heltall m, n, k, z kan gi massen målt av massespektrometeret.
Metoden for massespektrometri ble foreslått på begynnelsen av det tjuende århundre av Thompson.Forskere satt sammen verdens første massespektrometer ogmed hans hjelp gjorde han en stor oppdagelse: han bekreftet eksperimentelt eksistensen av isotoper. På den annen side var han ikke i stand til å gi en korrekt tolkning av resultatene sine. Eleven hans William Aston gjorde dette for ham: i 1922 mottok han Nobelprisen for denne oppdagelsen. På 1900-tallet, på grunn av en rekke verdenskriger, utviklet massespektrometri seg som en metode for militæret. I begynnelsen av utviklingen fant den sin hovedapplikasjon i atomindustrien. Siden massespektrometri kan skille stoffer etter masse og bestemme isotoper, kan den brukes til å skille isotoper som uran. Ytterligere to Nobelpriser ble delt ut for massespektrometri: i 1989 - Wolfgang Paul og Hans Dehmelt, og deretter i 2002 - en ekte revolusjon ble utført uavhengig av John Fenn og Kaishi Tanaka. De foreslo sin egen metode som gjør det mulig å få en ladet partikkel fra et stort polymermolekyl: fra proteiner eller fra nukleinsyrer, uten å ødelegge den. Dette satte fart på studiet. Nå kan ikke et eneste laboratorium – biokjemisk eller molekylærbiologisk laboratorium – operere uten eget massespektrometer eller uten et velutstyrt delt brukssenter ved instituttet.
Etter å ha bestemt massen til et ion, kan vi bare bestemme elementersammensetningen, men ikke strukturen til molekylene.Fordi en elementær sammensetning av forskjellige strukturer kan tilsvare et stort antall. Det vil si at atomene i et molekyl kan ordnes på forskjellige måter. Dette kalles fenomenet isomerisme.
Massespektrometrister har kommet opp med en metode som lar deg få litt mer informasjon om strukturen til et molekyl: en viss hindring er plassert i veien for flygende akselererte molekyler.Vanligvis er dette gassmolekyler.Når molekylene kolliderer med disse gassmolekylene, kan de bryte fra hverandre fra kollisjonen. Og så måler massespektrometeret ikke massen til det opprinnelige molekylet, men til bitene som det brøt opp i. Og dette forfallet skjer ikke tilfeldig, men langs de svakeste bindingene i molekylet. De resulterende fragmentene er identiske, og de er molekylære fingeravtrykk: unike for hvert molekyl.
Kromatografi er en metode for å skille stoffer basert på deres interaksjon med sorbenter.Sorbenter er noe som kan absorbereandre kjemikalier, og det enkleste er aktivt karbon, som vi tar ved forgiftning. På begynnelsen av 1900-tallet demonstrerte den russiske forskeren Mikhail Tsvet at hvis et slikt naturlig fargestoff føres gjennom en kolonne fylt med kritt, vil du få flere flerfargede flekker i stedet for en stor grønn flekker: fra gul til grønn. Dermed innså han for det første at det grønne fargestoffet fra bladene er en blanding av forskjellige stoffer. Og for det andre oppdaget han kromatografi, som i 1952 ble tildelt Nobelprisen for andre forskere som brakte metoden hans til en moderne form. I moderne kromatografi føres en blanding gjennom en kolonne ved hjelp av en væske eller gass, avhengig av typen kromatografi. Væsken "drar" molekylene fremover, mot utgangen av kolonnen, og sorbenten forstyrrer hvert molekyl på forskjellige måter. De ender opp med å forlate kolonnen til forskjellige tider, som kan registreres og brukes som et annet fingeravtrykk for identifikasjon.
Fra cerebrospinalvæskeundersøkelse til tørr blodmetode
Massespektrometri er den eneste metoden som for øyeblikket er tilgjengelig for å studere cerebrospinalvæske.I noen vanskelige tilfeller for diagnosesykdommer, en punktering er nødvendig, ryggraden er gjennomboret og en prøve av cerebrospinalvæske tas. Men problemet er at i gjennomsnitt har en person bare 120 ml cerebrospinalvæske. Og denne væsken er under trykk, så å ta selv 1 ml påvirker dette trykket betydelig og kan føre til irreversible konsekvenser for kroppen. Derfor er det i realiteten bare noen få mikroliter som kan tas prøver. Ingen av de eksisterende metodene bortsett fra massespektrometri kan håndtere så små mengder prøver, fordi jo mindre prøven er, jo færre molekyler har den og desto mer sensitivt må utstyret ditt være. Følsomheten til massespektrometri er vanligvis tilstrekkelig for dette. Etter innsamling fjernes prøven fra mekaniske inneslutninger og proteiner for å unngå utstyrssammenbrudd. Etter analyse behandles resultatet ved hjelp av en datamaskin og en "liste over funksjoner" oppnås: utgangen er omtrent 10–15 tusen linjer. Kolonnene produserer en formel som vi definerer med en nøyaktig masse, en intensitet som er proporsjonal med mengden av det molekylet, og et "fingeravtrykk."
Den mest direkte metoden for å bruke dettemetabolomics massespektrometri eksperiment - sammenligne syke og friske mennesker for å identifisere hvilke molekyler som vises, vises og endre konsentrasjonen deres når en slik forskjell oppstår.Vanligvis er det to grupper:friske mennesker og personer med en sykdom av interesse for oss, for eksempel med en bestemt form for onkologi. For hver prøve innhentes slike plater, og deretter sammenligner og visualiserer matematikere dem for å finne forskjeller mellom dem.
Den første anvendelsen av massespektrometri er i neonatal screening.Hver nyfødt, etter ordre fra Helsedepartementet med2006, er de pålagt å teste for et visst sett med arvelige sykdommer. Nå, i alle fall, i Moskva tester de for minst 16 forskjellige sykdommer. Det er slike sykdommer, og de manifesterer seg ofte helt fra de første minuttene av livet, som, hvis de ikke stoppes i tide, om en uke eller noen dager kan gjøre barnet ufør for livet. Derfor må slik diagnostikk gjøres i løpet av de første timene av en nyfødts liv. Biomarkørene for nesten alle disse sykdommene er småmolekylære metabolitter. Det vil si at sykdommer manifesterer seg i form av forstyrrelser i stoffskiftet, for eksempel akkumulering av visse organiske syrer i blodet eller visse lipider. Og naturlig nok skjer denne akkumuleringen i svært små konsentrasjoner fra dem er det nødvendig å gjenkjenne forskjellen i endringer i metabolisme. Derfor, foruten massespektrometri, vil ingen annen metode fungere her.
For å løse problemet med å samle blod fra barn (ikke så store mengder blod og barns frykt for invasive metoder og leger), kom de opp med en teknologi for å analysere tørkede blodflekker.Det lages en liten punktering og en eller flereto dråper blod direkte på et lite stykke filterpapir. Blodvolumet her er flere mikroliter. Deretter tørkes dette kortet og sendes til laboratoriet, og sendingen er også veldig praktisk: prøven trenger ikke å fryses eller tines. Bare løs opp dette kortet på nytt for analyse, og i løpet av få timer er analysen klar.
Et annet anvendelsesområde for massespektrometri er personlig medisin.Alle stoffene våre går til leveren, og leverenmetaboliserer dem på en eller annen måte. Dessuten fungerer leverene våre forskjellig for oss alle, ikke bare på grunn av noen sykdommer eller dårlige vaner. For eksempel kan grapefruktjuice påvirke stoffskiftet ditt betydelig, og det hemmer noen enzymer, og som et resultat kan konsentrasjonen av noen medikamenter være flere ganger høyere enn forventet. Noen mennesker vil ha denne konsentrasjonen i blodet etter å ha tatt stoffet, mens andre vil ha dobbelt så høy konsentrasjon. Det viser seg at dosen må halveres for ikke å forårsake unødvendig skade på kroppen. Derfor overgangen til personlig medisin. Du tar en pille, blodet ditt tas hver time og de ser på kurven: hvordan stoffet beveger seg gjennom kroppen din over tid, hva konsentrasjonen er i blodet. Deretter kan legen justere dosen eller til og med stoppe stoffet for deg og foreskrive en annen. Og i dette tilfellet brukes tørr blodanalyse også veldig aktivt.
Ethvert nytt stoff som kommer inn på markedet, går nødvendigvis gjennom et metabolsk forskningsstadium.Noen stoffer er kanskje ikke veldig giftige,men som følge av nedbrytning i leveren og enkelte feil, kan disse stoffene bli enda mer giftige. Det enkleste eksemplet er paracetamol. Instruksjonene for paracet sier at det ikke skal gis til små barn. At små barn kun skal få ibuprofen. Og årsaken til dette er akkumuleringen av dette molekylet i leveren, som, som et resultat av metabolisme, har en giftig effekt. For en voksen med en velutviklet lever er denne toksiske effekten lite merkbar, selv om du selvfølgelig heller ikke bør svelge paracet i glass. For små barn kan dette faktisk føre til alle slags ubehagelige og til og med irreversible konsekvenser. Derfor må hvert nytt medikament studeres for metabolisme.
Bildebehandling er en måte å gjennomføremassespektrometrisk analyse, når vi får informasjon ikke bare om en homogen, men også om en heterogen prøve, og vi kan studere dens molekylære sammensetning i rommet.Det er et så interessant eksempel for å studeredistribusjon av medikamentet og dets metabolitter i rottekroppen. Eksperimentet utføres som følger: en rotte får en bestemt medisin, etter noen timer blir dyret avlivet og deretter blir dyret finskåret langs hele kroppen. Og så lar en spesiell teknikk for massespektrometri deg studere den molekylære sammensetningen av hvert punkt i denne prøven. Etter databehandling er det mulig å visualisere hvor metabolittene har samlet seg. Det er viktig å studere fordelingen av metabolitter, for hvis du tar et medikament for lungebetennelse, er det viktig at det havner i lungene og ikke i hjernen. En massespektrometrisk skalpell er en "kniv" som pumper molekyler ut av snittstedet, og deretter, ved hjelp av datateknologi, er det mulig å bestemme hvilken kirurg som skjærer vevet: sykt eller sunt vev. Denne metoden blir nå implementert i USA, og den første virkelige operasjonen med en slik kniv er allerede utført.
Fingeravtrykk for hvert molekyl
Problemet er at flere hundre eller til og med tusenvis av kjemiske forbindelser kan tilsvare en elementær sammensetning.Derfor er det nødvendig å identifisere alle radertabeller, og dette er hovedoppgaven til moderne metabolomisk analyse, dessverre, den er ikke fullstendig løst. De molekylære fingeravtrykkene sammenlignes med de som finnes i databaser over kjemiske molekyler. Hvis de samsvarer, kan vi med en viss sikkerhet si at dette er det riktige molekylet. Men slike databaser inneholder et svært begrenset antall stoffer. Den komplette fingeravtrykkdatabasen inneholder omtrent 20–30 tusen forbindelser den dekker ikke engang alle primære og sekundære metabolitter som er tilstede i menneskekroppen. Det er et annet problem: for å fylle opp denne databasen trenger du et rent kjemisk stoff, og de er vanligvis dyre. Det vil si at ett rent kjemikalie vanligvis koster flere titalls eller hundrevis av dollar.
En tilnærming til identifikasjon er å lage nye fingeravtrykk.For eksempel utvikles metoden nå aktivtionemobilitetsspektrometri. Mens massespektrometri deler ioner etter masse, lar ionemobilitet dem separeres etter størrelse. Det vil si at hvis du har to løpere - ikke en tung og en lett, men en stor og en liten, og legger en slags hindring på veien - for eksempel et nett med celler, så vil en slank idrettsutøver krype raskt gjennom dette nettet og nå målstreken, men en feit vil. Inntil han kommer ut av dette nettet, kommer han løpende etter en stund.
Den andre metoden er å prøve å finne fingeravtrykk som ikke krever rene standarder for å identifisere.I laboratoriet foreslår vi å bruke den såkalte isotoputvekslingen.
For eksempel, hvis vi ser på et slikt molekyl, davi vil se at den har hydrogenatomer assosiert med oksygen. Så de er spesielle. De kan forlate dette molekylet og gå tilbake til det. Hvis vi har dette molekylet oppløst i vann, kan hydrogen forlate molekylet, og hydrogen kan komme tilbake fra vann. Og hvis vi ikke bare tar vann, men tungt vann, der det i stedet for hydrogen er deuterium, så kan hydrogen forlate molekylet, og deuterium kan ta plass. Det er kjent at deuterium skiller seg fra hydrogen i molekylvekt per enhet, og et massespektrometer kan se et slikt skifte. Bare ved å telle antall slike hydrogener, kan man si om dette er et nødvendig eller unødvendig molekyl, om vi identifiserte det riktig eller ikke.
Kunstig intelligens kan brukes til å identifisere molekyler.Basert på tilgjengelig informasjon kan du fullføredatabaser med manglende informasjon ved hjelp av dyplæringsmetoder. Det vil si at vi trener modellen, og den predikerer nødvendige fingeravtrykk basert på strukturen til molekylet, som vi så kan bruke til å sammenligne med det som ble oppnådd i forsøket.
Se også:
Uranus har mottatt statusen som den merkeligste planeten i solsystemet. Hvorfor?
Mennesker tåler veldig lave temperaturer selv uten varmekilder
Fysikere har laget en analog av et svart hull og bekreftet Hawkings teori. Hvor det fører?