Zastosowanie inżynierii genetycznej w badaniach naukowych
- Nokaut genu
Aby zbadać funkcję jednego lub drugiego
W przypadku nokautu syntetyzuje się ten sam gen lub jego fragment, modyfikuje się go w taki sposób, że produkt genu traci swoją funkcję. Główne metody realizacji: palec cynkowy, morfolino i TALEN.
Aby uzyskać myszy z nokautem, uzyskanoZmodyfikowany genetycznie konstrukt jest wprowadzany do embrionalnych komórek macierzystych, gdzie konstrukt przechodzi rekombinację somatyczną i zastępuje normalny gen, a zmienione komórki wszczepia się do blastocysty matki zastępczej. U muszki owocowej mutacje Drosophila inicjowane są w dużej populacji, w której następnie poszukiwane jest potomstwo z pożądaną mutacją. W podobny sposób wybija się rośliny i mikroorganizmy.
- Sztuczna ekspresja
Logicznym dodatkiem do nokautu jestsztuczna ekspresja, czyli dodanie do organizmu genu, którego wcześniej nie miał. Ta technika inżynierii genetycznej może być również wykorzystana do badania funkcji genów. Zasadniczo proces wprowadzania dodatkowych genów jest taki sam jak w przypadku nokautu, ale istniejące geny nie są zastępowane ani uszkadzane.
- Wizualizacja produktu genowego
Używane, gdy zadaniem jest naukalokalizacja produktu genu. Jedną z metod znakowania jest zastąpienie normalnego genu genem połączonym z elementem reporterowym, na przykład z genem białka zielonej fluorescencji GFP. Białko to, które fluoryzuje w świetle niebieskim, służy do wizualizacji produktu modyfikacji genetycznej.
Chociaż ta technika jest wygodna i użyteczna, jej skutki ubocznekonsekwencją może być częściowa lub całkowita utrata funkcji badanego białka. Bardziej wyrafinowaną, choć nie tak wygodną metodą jest dodanie do badanego białka nie tak dużych oligopeptydów, które można wykryć za pomocą specyficznych przeciwciał.
- Badanie mechanizmu ekspresji
W takich eksperymentach zadaniem jest naukawarunki ekspresji genów. Cechy ekspresji zależą przede wszystkim od małego fragmentu DNA znajdującego się przed regionem kodującym, zwanego promotorem, który służy do wiązania czynników transkrypcyjnych.
Ta strona jest wprowadzana do organizmu poprzez umieszczenie pozamiast własnego genu reporterowego, na przykład GFP lub enzymu, który katalizuje łatwo wykrywalną reakcję. Oprócz tego, że funkcjonowanie promotora w określonych tkankach w pewnym momencie staje się wyraźnie widoczne, takie eksperymenty pozwalają zbadać strukturę promotora poprzez usunięcie lub dodanie do niego fragmentów DNA, a także sztuczne wzmocnienie jego funkcji .
Dlaczego potrzebna jest inżynieria genetyczna człowieka?
W zastosowaniu do ludzi inżynieria genetyczna może:stosowany w leczeniu chorób dziedzicznych. Jednak technicznie istnieje znacząca różnica między leczeniem samego pacjenta a modyfikacją genomu jego potomstwa.
Zadanie zmiany genomu osoby dorosłejjest nieco bardziej skomplikowane niż hodowanie nowych genetycznie zmodyfikowanych ras zwierząt, ponieważ w tym przypadku konieczna jest zmiana genomu wielu komórek już utworzonego organizmu, a nie tylko jednego embrionalnego jaja. W tym celu proponuje się wykorzystanie cząstek wirusowych jako wektora.
Cząsteczki wirusa są w stanie przedostać się do środkaznaczny procent dorosłych komórek, osadzając w nich informację dziedziczną; możliwe jest kontrolowane rozmnażanie się cząstek wirusa w organizmie. Jednocześnie, aby ograniczyć skutki uboczne, naukowcy starają się unikać wprowadzania genetycznie zmodyfikowanego DNA do komórek narządów płciowych, unikając w ten sposób wpływu na przyszłych potomków pacjenta.
Warto również zwrócić uwagę na znaczącą krytykę tej technologii w mediach: rozwój genetycznie zmodyfikowanych wirusów jest przez wielu postrzegany jako zagrożenie dla całej ludzkości.
Za pomocą terapii genowej możliwa jest w przyszłości zmiana ludzkiego genomu. Obecnie skuteczne metody modyfikacji ludzkiego genomu są na etapie opracowywania i testów na naczelnych.
Wieloletnia inżynieria genetyczna małpnapotkały poważne trudności, ale w 2009 roku eksperymenty zakończyły się sukcesem: w czasopiśmie Nature ukazała się publikacja o skutecznym zastosowaniu genetycznie zmodyfikowanych wektorów wirusowych do wyleczenia dorosłego samca małpy ze ślepoty barw.W tym samym roku pojawił się pierwszy genetycznie zmodyfikowany naczelny (wyhodowana ze zmodyfikowanego jaja) urodziła potomstwo - marmozeta zwyczajna (Callithrix jacchus).
Chociaż na małą skalę, inżynieria genetyczna już to zrobiłastosowany, aby dać kobietom z pewnymi rodzajami niepłodności szansę na zajście w ciążę. Wykorzystuje się w tym celu jaja zdrowej kobiety. W rezultacie dziecko dziedziczy genotyp od jednego ojca i dwóch matek.
Jednak możliwość wprowadzenia bardziej znaczącychzmiany w ludzkim genomie borykają się z szeregiem poważnych problemów etycznych. W 2016 roku grupa naukowców w Stanach Zjednoczonych uzyskała zgodę na badania kliniczne metody leczenia raka z wykorzystaniem własnych komórek odpornościowych pacjenta, które są modyfikowane genetycznie przy użyciu technologii CRISPR/Ca9.
Pod koniec 2018 roku w Chinach urodziło się dwoje dzieci,którego genom został sztucznie zmieniony (wyłączono gen CCR5) na etapie embrionalnym metodą CRISPR/Cas9, w ramach prowadzonych od 2016 roku badań nad zwalczaniem wirusa HIV. Jeden z rodziców (ojciec) był zakażony wirusem HIV, a dzieci – jak wynika z oświadczenia – urodziły się zdrowe.
Ponieważ eksperyment był nieautoryzowany (wcześniejDlatego wszystkie takie eksperymenty na ludzkich embrionach były dozwolone tylko we wczesnych stadiach rozwoju z późniejszym zniszczeniem materiału doświadczalnego, to znaczy bez implantacji zarodka do macicy i narodzin dzieci), odpowiedzialny za to naukowiec zrobił to nie przedstawił dowodów na swoje wypowiedzi, które padły na międzynarodowej konferencji poświęconej edycji genomu.
Pod koniec stycznia 2019 r. władze chińskie oficjalnie potwierdziły fakty tego eksperymentu. W międzyczasie naukowiec otrzymał zakaz prowadzenia działalności naukowej i został aresztowany.
Jak edytowany jest ludzki genom?
- Metoda palców cynkowych
W składzie znajdują się również „palce cynkowe”białka ludzkie. Dzięki tej metodzie możliwe jest zaprojektowanie łańcucha ZFN tak, aby rozpoznawał określony odcinek DNA. Umożliwia to celowanie w określone obszary w obrębie złożonych genomów.
Domeny palca cynkowego znajdują się wludzkie czynniki transkrypcyjne – białka regulujące proces syntezy RNA z matrycą DNA. Tworząc sztuczne nukleazy, można skonstruować łańcuch „palców cynkowych”, tak aby rozpoznał konkretny odcinek DNA.
Jeśli taki łańcuch jest wystarczająco długi, topotrafi rozpoznać stosunkowo wydłużone sekwencje DNA składające się z wielu fragmentów trinukleotydowych. Oznacza to realną możliwość ukierunkowanego oddziaływania na określone obszary w obrębie dużych złożonych genomów.
Odkryto jednak również metodę „palca cynkowego”.poważne wady: po pierwsze, nie jest to bardzo ścisłe rozpoznanie powtórzeń trinukleotydów, co prowadzi do zauważalnej liczby rozszczepień DNA w regionach „niedocelowych”.
Po drugie metoda okazała się bardzo pracochłonna idrogie, ponieważ dla każdej sekwencji DNA konieczne jest stworzenie własnej zoptymalizowanej struktury białkowej nukleaz palca cynkowego. Dlatego system „palce cynkowe” nie jest rozpowszechniony.
- TALEN
W 2011 roku czasopismo Nature Methods nazwało systemTALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) „metoda roku” ze względu na szeroki zakres możliwych zastosowań w różnych obszarach nauk podstawowych i stosowanych.
TALEN to jedna z metod aplikacji celowanejprzerwanie DNA z jego późniejszym „gojeniem” - wyłączenie genów u myszy. Zaraz po nich technologia ta została wykorzystana do wprowadzenia mutacji do genomu myszy, co doprowadziło do rozwoju jednego z dziedzicznych zespołów. Autorom metody modelowania chorób genetycznie uwarunkowanych udało się nie tylko „zepsuć” mysi genom, ale także skorygować go z powrotem.
- CRISPR / Kasa9
Metoda zapewnia dokładny wpływ na określone regiony DNA i może być stosowana w prawie każdym nowoczesnym laboratorium biologii molekularnej.
Ten system opiera się na specjalnych obszarachbakteryjne DNA - CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats lub short palindromic cluster repeats). Te powtórzenia są oddzielone przerywnikami – krótkimi fragmentami obcego DNA. Te ostatnie są włączane do genomu po rekombinacji DNA z jego genomem.
Przykłady edycji przez ludzi
- Edycja genomu bezpośrednio w ciele
Choroba 44-letniego Briana mieszkającego w ArizonieMado objawił się we wczesnym dzieciństwie. Jest nieuleczalna i dziedziczona głównie przez mężczyzn. Mukopolisacharydoza typu II jest zaburzeniem metabolicznym: osoby z nim mają mutację w genie odpowiedzialnym za produkcję enzymu, który bierze udział w rozpadzie węglowodanów złożonych. W rezultacie gromadzą się w komórkach i powodują liczne patologie narządów.
Mężczyzna zdecydował się wziąć udział w badaniach klinicznychtestowanie nowej metody - terapii genowej. To dopiero pierwsza faza badań i przed rejestracją terapii (czyli przed zezwoleniem na stosowanie tej metody u wszystkich pacjentów z zespołem Huntera) musi ich być trzech.
Metoda zastosowana w przypadku BrianaMado pozwala na edycję genomu bezpośrednio w organizmie człowieka – a jednocześnie pozwala na dokładne namierzenie konkretnego fragmentu DNA. Edycja odbywa się za pomocą tzw. „palców cynkowych”.
- Dzieci zmodyfikowane genetycznie
Chiński badacz He Jiankui edytował genomy ludzkich embrionów przed zapłodnieniem in vitro, co dało dwoje dzieci ze zmienionym DNA.
Badacz systemu CRISPR / Cas9edytował genomy siedmiu par embrionów podczas leczenia reprodukcyjnego. W wyniku jednej z ciąż dwie bliźniaczki ze zmienionym DNA urodziły się ze zdrowej matki i ojca zakażonego wirusem HIV. Jiankui wyjaśnił, że usunął gen CCR5 z dzieci, co dało im dożywotnią odporność na HIV.
- Powrót widzenia z terapią genową
Aby przywrócić wzrok, można zastosować technologie optogenetyczne, za pomocą których można kontrolować pracę neuronów za pomocą światłoczułych białek bakterii i błysków laserowych.
Kierując się tą ideą, biolodzy stworzyli wirusa,które mogą penetrować neurony zwojowe. Te komórki nerwowe są odpowiedzialne za przekazywanie sygnałów z siatkówki do ludzkiego mózgu. W nerwicy zwojowej wirus powoduje, że wytwarza on podobne cząsteczki sygnałowe. Jednak ta procedura sama w sobie nie przywraca wzroku, ponieważ białka bakterii reagują na światło inaczej niż pręciki i czopki siatkówki.
Aby rozwiązać ten problem, profesor z BazyleiUniwersytet Botond Rosca i profesor José Sahel z University of Pittsburgh stworzyli specjalne okulary, które przekształcają przychodzący obraz w format zrozumiały dla mózgu i stymulują komórki zwojowe za pomocą błysków laserowych. W rezultacie pacjent może zobaczyć sylwetki dużych obiektów i przedmiotów oraz wykonywać inne złożone czynności.
Czytaj więcej:
Naukowcy przetestowali teorię panspermii na niesporczakach: mogą podróżować w kosmosie
Naukowcy odkryli, że super wzbogacone złoto powstaje w postaci jogurtu
Malutki silnik wodorowy zastępuje odpowiedniki paliw kopalnych