Dmitry Madera - chefe do departamento de genética molecular da BIOCAD, professor sênior da SPUFU, Ph.D.
Em 2002, ele se formou na Faculdade de Biologia da Universidade Estadual de Moscouespecializando-se em genética. Ele defendeu sua tese para o grau de Doutor em Filosofia em Biologia no programa para o estudo da função e expressão gênica na Universidade de Massachusetts, após o qual trabalhou no National Institutes of Health, estudando os aspectos moleculares do desenvolvimento do câncer e como influenciá-los. Em 2015, chefiou o laboratório de genética molecular do BIOCAD e, desde então, atua no desenvolvimento de produtos de terapia genética. O autor de uma patente internacional que descreve uma nova nuclease da família Cas9 e artigos no campo do desenvolvimento do câncer.
He Jiankui experimento, o risco de oncologia em meninas nascidas e mutações direcionadas
— O que você acha do experimento do biofísico chinês He Jiankui, que editou o genoma de dois embriões? Especialistasreivindicarque meninas nascidas podem ter mutações. Como evitar isso?— Tendo estudado a fonte original (pesquisa do MIT —"Alta tecnologia") e pelo comentário do geneticista Fyodor Urnov, percebi que a mídia está distorcendo um pouco as informações. Sim, as meninas são mais propensas a ter mutações. Isso se refere às mutações que não se sabe exatamente onde ocorrerão. E agora é difícil estabelecer exatamente onde surgiram as mutações aleatórias como resultado da influência do CRISPR/Cas9. Para isso, é preciso fazer uma comparação com os pais das meninas.
Formalmente, esta é a afirmação correta:Mutações oftarget podem de fato existir. E não há nada que você possa fazer sobre isso. E os métodos modernos de edição genética não impedem isso. Na verdade, esse é o problema, porque pode ser perigoso.
No final de 2018, o cientista chinês He Jiankuianunciou que ele era capaz de criar meninas gêmeas geneticamente modificadas com imunidade inata ao HIV. Ele disse que editou os embriões de casais submetidos à fertilização in vitro, e uma das sete tentativas foi bem-sucedida. O experimento desencadeou uma nova onda de discussões sobre a ética de interferir no código genético humano.
No entanto, Fedor Urnov, especialista em ediçãoO genoma da Universidade da Califórnia, em entrevista à MIT Technology Review, observou: "A alegação de que reproduziu o CCR5 predominante é uma deturpação flagrante" e acrescentou que isso só pode ser descrito como "deturpação intencional".
Um novo estudo do MIT mostrou que os cientistas nãoforam capazes de reproduzir a versão predominante do CCR5. Embora a equipe visasse o gene certo, os pesquisadores não copiaram a variação desejada do Delta 32, mas criaram novas edições, cujo efeito não é claro - embora possam causar mutações.
Alegando que He Jiankui foi incapaz de sofrer mutaçãoo gene CCR5 (o gene que permite ao HIV infectar células humanas - Hi-Tech) está incorreto. Na verdade, atingiu o seu objectivo e o CCR5 sofreu uma mutação e já não funciona, o que significa que o VIH não consegue infectar células. Sim, aparentemente ele não conseguiu reproduzir um alelo natural específico encontrado em populações humanas, mas, mesmo assim, o CCR5 está “nocauteado” e não funciona, o que significa que Jiankui atingiu o objetivo mínimo.
Para evitar mutações fora do alvo,é necessário melhorar os métodos de edição do genoma, para aumentar sua precisão. Assim, no futuro, será possível reduzir o risco de mutações para o nível de fundo e depois se acalmar com o fato de que as mutações ocorrem naturalmente. Como se costuma dizer, não é necessário ser mais santo que o papa.
- Ou seja, quando essas meninas crescerem, não será realista entender exatamente quais mutações elas tiveram como resultado das ações de Jiankui?
- Falando especificamente sobre o CCR5, é claro,é possível E para todo o genoma - em princípio, é possível agora, se você pegar o material genético do pai e da mãe e compará-lo com o seu. Então ficará claro quais opções os pais têm e quais estão presentes no genoma das meninas, nem a mãe nem o pai. Outra coisa é que será impossível descobrir quais mutações surgiram como resultado do CRISPR / Cas e quais aleatoriamente. Você só pode comparar a frequência dessas mutações: quantas mutações normais ocorrem no nascimento e quantas dessas meninas as têm. Se houver uma ordem de magnitude maior, tudo estará claro.
A tecnologia de edição do genoma CRISPR/Cas9 tem o potencial de erradicar milhares de doenças hereditárias que antes eram consideradas incuráveis.
A principal diferença entre uma ferramenta genéticaeditar CRISPR / Cas9 a partir de outros métodos existentes por tempo suficiente - esta é a possibilidade de alterações direcionais do DNA. O CRISPR / Cas9 permite influenciar especificamente a sequência de DNA e até alterar o gene quebrado para o correto. Para fazer isso, uma enzima especial, a nuclease, introduz uma lacuna no lugar certo no genoma, após o qual o sistema de reparo é ativado - os mecanismos internos da célula para restaurar o genoma. Nesse caso, o DNA é reparado no local do intervalo, como regra, com erros aleatórios, o que provavelmente leva à perda ou inserção de várias letras na sequência e ao aparecimento de mutações. Portanto, ela pesquisa como amostra a sequência desejada nos genomas vizinhos. Segundo a tecnologia, a célula deve encontrar essa sequência em fragmentos especiais de DNA. Sua genética é introduzida na célula para pegá-la e introduzi-la independentemente em si mesma. No entanto, mutações aleatórias no local da ruptura ocorrem com muito mais frequência do que a reparação direcionada ao longo da amostra.
Outra pergunta, Konstantin Severinov (Russoum especialista na área de biologia molecular e CRISPR/Cas - Hi-Tech) certa vez expressou uma ideia interessante de que se houvesse algo completamente terrível ali, as meninas simplesmente não teriam sobrevivido mesmo na fase de embriogênese. Muito provavelmente, nada de fundamental no seu genoma foi afetado. A única coisa que me assusta é a oncologia. Eu realmente espero que eles não tenham doenças semelhantes.
Porque? A oncologia se torna mais provável como resultado da edição do genoma humano?
- Certamente. Vamos dar uma olhada nas causas do câncer.São três: mutações hereditárias, ou seja, alelos especiais que carregam a probabilidade de aumentar o risco de câncer, como Angelina Jolie; causas virais – papilomavírus humano, por exemplo; e mutações aleatórias. É precisamente a ocorrência de mutações deste último tipo nas meninas do experimento chinês que temo, especialmente se ali houve uma alta frequência de mutações. Então a probabilidade de ocorrência de tumores de qualquer tipo é diferente de zero.
Dmitry Madera. Foto de : Science Bar Hopping
Como editar o genoma humano, os principais países e o destino da genética russa
- Quanto mais fácil é realizar tais experimentos com animais?
— Para editar o genoma de cada animalvocê precisa de seu próprio protocolo. Você precisa editar um rato ou uma vaca usando protocolos diferentes. E o homem, como qualquer outro animal, exige seu desenvolvimento para poder editar seu genoma de maneira mais eficaz. Portanto, não se pode dizer que seja mais difícil editar uma pessoa do que uma vaca. Você só precisa fazer isso de forma diferente do que com um camundongo ou rato. Mas as abordagens permanecem as mesmas. Não há nada de muito diferente em nós.
- Aquilo éo problema reside apenas no campo da ética e das leis? E se fosse decidido, haveria mais experimentos?
- Sem dúvida.E então, na verdade, existem muitos experimentos. Vou a conferências e frequentemente encontro colegas. Por exemplo, a Universidade de Oregon está conduzindo excelentes experimentos sobre edição do genoma humano e cultivo de embriões. Eles são simplesmente destruídos posteriormente em um determinado estágio inicial. Tais experimentos não são proibidos. Na verdade, a única limitação é a implantação de um embrião e o seu cultivo até o nascimento.
- Quais países são líderes em pesquisa sobre edição do genoma humano hoje?
— Existem dois desses líderes agora, entre eles e todoso resto é um abismo absoluto. Estes são os EUA e a China. Ninguém está ainda mais perto, eles estão tão distantes do resto do mundo em suas pesquisas.
- Está relacionado com financiamento ou base científica?
- Com ambos.A China está investindo muito dinheiro em pesquisa, o seu governo está muito preocupado com isso. E se antes eles simplesmente copiavam tecnologia, agora os cientistas chineses estão fazendo coisas interessantes. E nos EUA existe simplesmente uma base científica muito forte. Na verdade, onde foram descobertos todos esses CRISPR/Cas? A maioria dos descobridores deste método, exceto Jennifer Doudna, são chineses, mas trabalham nos EUA. Portanto, houve uma grande sinergia entre os dois países.
— O que impede a Rússia de se desenvolver nesta área? Até o presidentedeclaradosobre a prioridade da pesquisa na direção da genética.
- Eu vou dizer isso, hoje já existe financiamentopesquisa - muito dinheiro é alocado. Mas, é claro, tudo isso não é feito em uma hora. Precisamos de uma base científica e escola. Na Rússia, em termos de genética, tudo fica triste depois do lisenkoismo. Antes de Lysenko, a escola soviética de genética era uma das melhores do mundo. Vavilov foi para Morgan (Thomas Morgan - um dos fundadores da genética, o Prêmio Nobel - "High Tech"), e eles se comunicaram em termos iguais. Depois de Lysenko, tudo foi destruído de maneira bárbara. E desde então não podemos nos recuperar. Sim, dinheiro é muito importante. Mas também é necessário que as crianças estudem, para que especialistas estrangeiros estejam envolvidos. E se houver uma escola, haverá edição genômica na Rússia.
- Como isso será influenciado pelas recomendações recentes sobre a comunicação entre cientistas russos e estrangeiros - para relatar todos os contatos, praticamente para se comunicar, como na União Soviética?
- Isso é muito assustador. A pior coisa que pode ser feita pela ciência russa e matá-la completamente são essas recomendações. E entendo que estas são apenas recomendações e não precisam ser seguidas. Mas as pessoas, você sabe, têm medo. E eles começam a executá-los de forma proativa. Especialmente não cientistas, mas burocratas da ciência. Eles vão começar a parar de se comunicar com cientistas estrangeiros. Conheço a história quando cônjuges científicos da Alemanha compareceram a alguma conferência na Rússia por algum tempo, e cientistas estrangeiros não costumam vir até nós e não foram autorizados a entrar no evento devido a esses requisitos. A ciência é internacional, e você precisa se comunicar e interagir com os colegas o máximo possível, e então será bom. Eu condeno fortemente esses requisitos.
Tratamento de surdez, doenças perigosas e administração de medicamentos
— geneticista russo Denis Rebrikovindo paraeditar o genoma de embriões para casais com deficiência auditiva. Qual é a probabilidade do sucesso de tal experimento?
— Denis Vladimirovich levou em consideração todos os seus errosColega chinês. Ele fará o sequenciamento completo do genoma. E o experimento em si acontecerá em um ambiente mais controlado, e não em condições semi-subterrâneas, como foi o caso de Jiankui. Acho que o sucesso, em princípio, do ponto de vista metodológico, é possível, e acontece que nem tudo é tão assustador, principalmente quando se utilizam métodos modernos. E o nível de mutação pode estar no nível de fundo. Quanto a essas crianças doentes, sim, é uma mutação monogênica, e é dominante, ou seja, é muito fácil destruí-la, o que os geneticistas já fazem bem. E, de fato, é isso, nada mais atrapalha.
— Como é que isto se enquadra na legislação russa?
- Quanto aos aspectos legislativos, Rebrikovapenas funciona nisso. E, nesse sentido, é muito interessante saber o que acontece lá. Eu realmente gostaria que ele conseguisse romper esse muro legislativo. Embora seu exemplo e a doença que ele escolheu, na opinião de muitos de meus colegas e meus, não sejam tão relevantes. Mas o campo está abrindo muito, então seja o primeiro e mostre um bom resultado. E ainda será possível expandir o "repertório".
- Que outras doenças perigosas podem ser tratadas com CRISPR / Cas?
— Claro, a fibrose cística é uma doença muito sériadoença. É possível utilizar a edição genética no tratamento da distrofia muscular de Duchenne, pelo menos em alguns pacientes que apresentam uma mutação mais ou menos adequada para isso. Em geral, existem mais de 10 mil doenças genéticas monogênicas e aqui a questão é qual método é mais conveniente e simples de tratar. Por exemplo, a atrofia muscular espinhal não deve ser tratada com edição, mas simplesmente com terapia de substituição genética.
Fibrose cística- doença hereditária sistêmica,causada por uma mutação no gene do regulador transmembrana da fibrose cística e caracterizada por danos às glândulas exócrinas e disfunção grave dos órgãos respiratórios. A fibrose cística é de particular interesse não só devido à sua prevalência generalizada, mas também porque foi uma das primeiras doenças hereditárias a ser tratada. A fibrose cística foi reconhecida pela primeira vez como uma entidade distinta por Dorothy Andersen em 1938.
Miodistrofia de Duchenne- causado por exclusões ou duplicações de umou vários exons ou mutações pontuais no gene da distrofina. A principal manifestação é a fraqueza muscular, dificuldade de movimentação desde a infância, que progride com o tempo. A morte geralmente ocorre na segunda ou terceira década de vida. Sua duração média é de 25 anos, mas há pessoas que vivem mais.
- Quando os cientistas serão capazes de fazer isso? Qual é o intervalo de tempo?
- Olha, os animais já estão sendo tratados.É verdade que primeiro eles “mutilam”, é claro (ou seja, fazem modelos de animais para estudar doenças), e depois tratam. Mas tudo isso só chega a uma clínica consciente e, via de regra, dura de 5 a 15 anos. E pelo que entendi, por se tratar de uma abordagem completamente nova, os primeiros estudos clínicos levarão muito tempo. Isso significa que teremos que esperar 15–20 anos. Aí vai ficar assim: venha, seja diagnosticado e tratado imediatamente.
Dmitry Madera. Foto: Science Bar Hopping
- Ou seja, não se trata de editar o genoma dos embriões, mas de tratar os adultos?
— Ambas as abordagens serão possíveis.
- Vamos conversar sobreedição de genessem quebra dupla. Por que os cientistas não conseguiram fazer isso antes?
“A questão é que não é nada fácil.”Quando li pela primeira vez a publicação da Nature, pensei: “Ah, como não pensei nisso?” Brincadeiras à parte, deu muito trabalho, porque inicialmente existia uma ideia semelhante, mas quando os cientistas tentaram, não tiveram sucesso. Então eles começaram a alterar a transcriptase reversa, essencialmente modificando-a para fazê-la funcionar de maneira diferente. E já em uma certa iteração começou a funcionar e começou a produzir algo assim. Foi um processo que exigiu muito tempo e financiamento. Portanto, não me surpreende que tenha passado tempo desde a invenção do simplesmente CRISPR/Cas até o advento do método que utiliza transcriptase reversa. Porque não é trivial.
- Que oportunidades estão se abrindo graças a esse novo método?
- As oportunidades são ótimas, porque agoraacontece que podemos, com riscos mínimos de ocorrência de mutações alvo, alterar muito especificamente qualquer alelo de gene. Por exemplo, se queremos estabelecer uma mutação pontual, crie uma exclusão ou uma substituição complexa. Isso nos dá grandes oportunidades, porque, em geral, geralmente uma ou duas mutações ou deleções que surgem são pequenas e podem ser restauradas dentro de 40 a 50 nucleotídeos.
De fato, havia tecnologias um pouco antes -editores de nucleotídeos que simplesmente aceitaram e substituíram, por exemplo, "A" por "G" ou "C" por "T". Tais trabalhos foram e ainda são usados, mas, é claro, tudo não é simples, porque acontece que eles editam não apenas DNA, mas também RNA, e não dizem que são muito precisos - não estão editando exatamente um nucleotídeo e toda a "janela". Talvez isso também se desenvolva posteriormente em uso prático. Mas até agora existem muitos problemas. Lembrei-me desse método porque também não envolve quebras de fita dupla. E surgiu um pouco mais cedo do que esses estudos recentes.
— Engenheiros do MIT e das universidades de HarvardusadoCRISPR para criar um sistema de entrega de medicamentos que os libere apenas em um momento específico. Como exatamente isso acontece?
- Falando especificamente sobre esse método, entãoa essência é que o DNA é um polímero, e Cas12a o corta, destruindo a estrutura do polímero. Se o DNA é incorporado ao hidrogel, as substâncias que foram previamente fixadas no hidrogel com as fitas de DNA são então liberadas. Ou seja, aqui o DNA age simplesmente como material físico que pode ser decomposto de maneira controlada. Em geral, os hidrogéis são usados em feridas e outras lesões quando é necessária uma liberação gradual de drogas.
Em princípio, o CRISPR/Cas poderia entregar algonecessário para uma posição no genoma. Isso é tudo que ele pode fazer. Mas não pode entregar o medicamento na célula. Portanto, não é totalmente correto falar sobre seu uso para administração de medicamentos.
Mas entregar CRISPR / Cas comodrogas na célula; são necessários métodos de entrega. E eles existem - eles podem ser virais e não virais. Os vírus, é claro, evoluíram ao longo de sua história para fornecer certo material genético à célula. Eles se multiplicam. E os métodos não virais são simplesmente métodos químicos, quando alguns portadores são criados contendo dentro de si moléculas de ácido nucleico, e não necessariamente DNA, a propósito, pode até ser RNA ou proteína. Geralmente, são algumas gotículas de gordura que protegem o que devem liberar das nucleases e proteases, e também podem ser pendurados anticorpos para dar especificidade a uma célula específica. E esses complexos lipofílicos entregam drogas para a célula. E existem trabalhos relacionados a polímeros complexos ou nanopartículas de ouro, que, como um canhão, queimam células, voam para eles e entregam seu conteúdo, como um canhão genômico.
- É possível prolongar significativamente a vida de uma pessoa graças à edição de genes? Quanto isso pode ser feito e que doenças precisam ser curadas dessa maneira?
– É uma pergunta difícil.O fato é que existem mutações que nos animais provocam um certo prolongamento da vida, uma desaceleração do envelhecimento. Eles geralmente estão associados ao sistema de reparo do DNA. Em muitos aspectos, o envelhecimento é uma consequência da acumulação de erros aleatórios que levam à activação de elementos retrovirais e, como resultado, o genoma não é regulado e começa a trabalhar contra o seu hospedeiro. Há um ponto aqui, não sabemos como isso funcionará nas pessoas. Infelizmente, e isto foi uma grande surpresa, os mecanismos de envelhecimento e de proteção contra ele são muito específicos da espécie. E para os humanos, os mesmos ratos não são um modelo totalmente adequado. E quanto mais adequado for o modelo e quanto mais tempo durar, mais difícil será trabalhar com ele. Por exemplo, o mesmo SIRT6 - nas espécies de vida longa é um, e nas espécies de vida curta é diferente, há uma correlação clara. Parecia que pegar e inserir SIRT6 de um elefante em uma pessoa. Ou várias cópias da SIRT6 humana (o gene que codifica a proteína sirtuína-6 ajuda a corrigir danos no DNA - quebras de fita dupla e substituições em letras de nucleotídeos genéticos - Hi-Tech). Isso pode funcionar ou não. Existe essa possibilidade e é claro que eu tentaria. Mas se falamos em prolongar a vida, provavelmente precisaremos editar genes associados ao reparo do DNA. Hoje, porém, para um organismo como a pessoa, isso é apenas uma hipótese.