Aplicação da engenharia genética na pesquisa científica
- Nocaute de gene
Para estudar a função de um ou outro
Para o nocaute, sintetiza-se o mesmo gene ou seu fragmento, modificado para que o produto do gene perca sua função. Principais métodos de implementação: dedo de zinco, morfolino e TALEN.
Para obter ratos knockout, oA construção geneticamente modificada é introduzida em células-tronco embrionárias, onde a construção sofre recombinação somática e substitui o gene normal, e as células alteradas são implantadas no blastocisto da mãe substituta. Na mosca da fruta, as mutações da Drosophila são iniciadas em uma grande população, na qual a prole com a mutação desejada é então procurada. Plantas e microrganismos são eliminados de maneira semelhante.
- Expressão Artificial
Uma adição lógica ao nocaute éexpressão artificial, ou seja, a adição de um gene ao corpo que ele não tinha antes. Essa técnica de engenharia genética também pode ser usada para estudar a função dos genes. Em essência, o processo de introdução de genes adicionais é o mesmo do knockout, mas os genes existentes não são substituídos ou danificados.
- Visualização do produto do gene
Usado quando a tarefa é estudarlocalização do produto gênico. Um dos métodos de marcação é substituir o gene normal por um fundido com um elemento repórter, por exemplo, com o gene da proteína fluorescente verde GFP. Essa proteína, que apresenta fluorescência em luz azul, é usada para visualizar o produto da modificação genética.
Embora essa técnica seja conveniente e útil, seus efeitos colateraisas consequências podem ser a perda parcial ou completa da função da proteína em estudo. Um método mais sofisticado, embora não tão conveniente, é adicionar à proteína em estudo oligopeptídeos não tão grandes que possam ser detectados usando anticorpos específicos.
- Investigação do mecanismo de expressão
Em tais experimentos, a tarefa é estudarcondições de expressão genética. As características de expressão dependem principalmente de um pequeno pedaço de DNA localizado na frente da região codificadora, denominado promotor, que serve para ligar fatores de transcrição.
Este site é introduzido no corpo, colocando-o apósem vez de seu próprio gene repórter, por exemplo, GFP ou uma enzima que catalisa uma reação facilmente detectável. Além do fato de que o funcionamento do promotor em determinados tecidos em um momento ou outro se torna claramente perceptível, tais experimentos tornam possível estudar a estrutura do promotor por meio da remoção ou adição de fragmentos de DNA a ele, bem como aumentar artificialmente suas funções.
Por que a engenharia genética humana é necessária?
Quando aplicada a humanos, a engenharia genética poderiausado para tratar doenças hereditárias. No entanto, tecnicamente, há uma diferença significativa entre tratar o próprio paciente e modificar o genoma de sua prole.
A tarefa de mudar o genoma adultoé um pouco mais complicado do que criar novas raças de animais geneticamente modificados, pois neste caso é necessário alterar o genoma de numerosas células de um organismo já formado, e não apenas de um óvulo embrionário. Para isso, propõe-se a utilização de partículas virais como vetor.
Partículas virais são capazes de penetraruma porcentagem significativa de células adultas, incorporando nelas suas informações hereditárias; a reprodução controlada de partículas virais no corpo é possível. Ao mesmo tempo, para reduzir os efeitos secundários, os cientistas tentam evitar a introdução de ADN geneticamente modificado nas células dos órgãos genitais, evitando assim o impacto nos futuros descendentes do paciente.
Também é importante notar a crítica significativa a essa tecnologia na mídia: o desenvolvimento de vírus geneticamente modificados é percebido por muitos como uma ameaça para toda a humanidade.
Com a ajuda da terapia genética, é possível no futuro alterar o genoma humano. Atualmente, métodos eficazes para modificar o genoma humano estão em fase de desenvolvimento e testes em primatas.
Engenharia genética de macacos de longa dataenfrentou sérias dificuldades, mas em 2009 os experimentos foram coroados de sucesso: apareceu uma publicação na revista Nature sobre o uso bem-sucedido de vetores virais geneticamente modificados para curar um macaco adulto macho do daltonismo. No mesmo ano, o primeiro primata geneticamente modificado (cultivado a partir de um ovo modificado) deu à luz uma prole. - sagui comum (Callithrix jacchus).
Embora em pequena escala, a engenharia genética jáusado para dar às mulheres com certos tipos de infertilidade a chance de engravidar. Os óvulos de uma mulher saudável são usados para isso. Como resultado, a criança herda o genótipo de um pai e duas mães.
No entanto, a possibilidade de introdução de mais significativaAs mudanças no genoma humano se deparam com uma série de problemas éticos sérios. Em 2016, um grupo de cientistas dos Estados Unidos recebeu aprovação para ensaios clínicos de um método de tratamento de câncer usando as próprias células do sistema imunológico do paciente, que são geneticamente modificadas usando a tecnologia CRISPR / Cas9.
No final de 2018, nasceram duas crianças na China,cujo genoma foi alterado artificialmente (o gene CCR5 foi desligado) na fase embrionária pelo método CRISPR/Cas9, como parte de pesquisas realizadas desde 2016 para combater o HIV. Um dos pais (pai) estava infectado pelo HIV e os filhos, segundo o depoimento, nasceram saudáveis.
Como o experimento não foi autorizado (antesPortanto, todos esses experimentos em embriões humanos foram permitidos apenas nos estágios iniciais de desenvolvimento com a posterior destruição do material experimental, ou seja, sem implantação do embrião no útero e nascimento de filhos), o cientista responsável por isso fez não forneceu evidências para suas declarações, feitas em uma conferência internacional sobre edição de genoma.
No final de janeiro de 2019, as autoridades chinesas confirmaram oficialmente os fatos desta experiência. Nesse ínterim, o cientista foi proibido de se envolver em atividades científicas e foi preso.
Como o genoma humano é editado?
- Método de dedos de zinco
"Dedos de zinco" são encontrados na composiçãoproteínas humanas. Graças a este método, é possível projetar uma cadeia ZFN de forma que ela reconheça uma seção específica do DNA. Isso torna possível visar áreas específicas dentro de genomas complexos.
Domínios de dedo de zinco são encontrados emfatores de transcrição humana - proteínas que regulam o processo de síntese de RNA com o modelo de DNA. Ao criar nucleases artificiais, é possível construir uma cadeia de “dedos de zinco” para que reconheça uma seção específica do DNA.
Se essa corrente for longa o suficiente,pode reconhecer sequências de DNA relativamente estendidas que consistem em uma série de fragmentos de trinucleotídeos. Isso significa uma possibilidade real de impacto direcionado em áreas específicas dentro de grandes genomas complexos.
No entanto, o método do “dedo de zinco” também revelousérias desvantagens: em primeiro lugar, este não é um reconhecimento muito estrito de repetições de trinucleotídeos, o que leva a um número notável de clivagens de DNA em regiões “não-alvo”.
Em segundo lugar, o método acabou sendo muito trabalhoso ecaro, pois para cada sequência de DNA é necessário criar sua própria estrutura protéica otimizada de nucleases de dedo de zinco. Portanto, o sistema "dedos de zinco" não é muito difundido.
- TALEN
Em 2011, a revista Nature Methods nomeou o sistemaTALEN (Nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição) "método do ano" devido a uma ampla gama de aplicações possíveis em diferentes áreas da ciência fundamental e aplicada.
TALEN é um dos métodos de aplicação direcionadaquebra no DNA com sua "cura" subsequente - para desligar genes em ratos. Imediatamente após eles, essa tecnologia foi usada para introduzir uma mutação no genoma do camundongo, levando ao desenvolvimento de uma das síndromes hereditárias. Os autores do método de modelagem de doenças determinadas geneticamente conseguiram não apenas "estragar" o genoma do camundongo, mas também corrigi-lo de volta.
- CRISPR / Cas9
O método fornece um efeito preciso em regiões específicas do DNA e pode ser usado em quase qualquer laboratório de biologia molecular moderno.
Este sistema é baseado em áreas especiaisDNA bacteriano - CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas com Espaçamento Intermediário Regular ou Repetições Palindrômicas Curtas). Essas repetições são separadas por espaçadores - pequenos fragmentos de DNA estranho. Os últimos são incorporados ao genoma após a recombinação do DNA com seu genoma.
Exemplos de edição humana
- Edição de genoma direto no corpo
Doença de Brian, residente de 44 anos do ArizonaMado se manifestou na primeira infância. É incurável e é herdado principalmente pelos homens. A mucopolissacaridose tipo II é um distúrbio metabólico: as pessoas com ela apresentam uma mutação em um gene responsável pela produção de uma enzima que está envolvida na quebra de carboidratos complexos. Como resultado, eles se acumulam nas células e causam inúmeras patologias nos órgãos.
O homem decidiu participar da clínicatestando um novo método - terapia genética. Esta é apenas a primeira fase do estudo, e antes do registro da terapia (ou seja, antes da permissão para o uso deste método para todos os pacientes com síndrome de Hunter), deve haver três deles.
Método usado no caso de BrianMado permite editar o genoma diretamente no corpo humano - e ao mesmo tempo atingir com precisão uma seção específica do DNA. A edição ocorre usando os chamados “dedos de zinco”.
- Crianças geneticamente modificadas
O pesquisador chinês He Jiankui editou os genomas de embriões humanos antes da fertilização in vitro, resultando em duas crianças com DNA alterado.
Pesquisador do sistema CRISPR / Cas9editou os genomas de embriões de sete casais durante o tratamento reprodutivo. Como resultado de uma das gestações, duas meninas gêmeas com DNA alterado nasceram de uma mãe saudável e de um pai infectado pelo HIV. He Jiankui explicou que removeu o gene CCR5 das crianças, o que lhes deu imunidade vitalícia ao HIV.
- Retornando a visão com terapia genética
Para restaurar a visão, tecnologias optogenéticas podem ser usadas, com a ajuda das quais o trabalho dos neurônios pode ser controlado por meio de proteínas de bactérias sensíveis à luz e flashes de laser.
Guiados por essa ideia, os biólogos criaram um vírus,que pode penetrar nos neurônios ganglionares. Essas células nervosas são responsáveis pela transmissão de sinais da retina para o cérebro humano. Uma vez na neurose ganglionar, um vírus faz com que ela produza moléculas de sinalização semelhantes. No entanto, esse procedimento não restaura a visão por si só, uma vez que as proteínas das bactérias reagem à luz de maneira diferente dos bastonetes e cones da retina.
Para resolver este problema, o professor de BaselO professor José Sahel da Botond Rosca University e da University of Pittsburgh criou óculos especiais que transformam a imagem recebida em um formato compreensível para o cérebro e estimulam as células ganglionares com flashes de laser. Como resultado, o paciente pode ver as silhuetas de grandes objetos e objetos e realizar outras ações complexas.
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