O laboratório de espectrometria de massa da Skoltech é chefiado por um membro correspondente da Academia Russa de Ciências
O que está no cerne dos processos de construção da vida
O DNA é uma longa cadeia de polímero que armazena informações sobre como o corpo deve se parecer e funcionar.Ou seja, como diferimos de outras espéciese como dois indivíduos da mesma espécie diferem um do outro. Essas moléculas determinam nossa singularidade. Deixe-me dar um exemplo: uma lagarta e a borboleta na qual ela cresce. Você acha que suas moléculas de DNA são diferentes ou iguais? Na verdade, a resposta correta é: a mesma coisa. A informação genética não muda de forma alguma durante a vida. Na verdade, por que as lagartas e as borboletas são diferentes no final das contas? Porque nem todas as informações armazenadas no DNA são realizadas ao mesmo tempo. A implementação ocorre através do processo de transcrição, pelo qual, após a leitura dos genes individuais, o RNA mensageiro permite a síntese de proteínas.
As proteínas são máquinas moleculares universais em nosso corpo que desempenham diferentes funções: da construção à regulação.Uma das definições desatualizadas de vida éexistência ordenada e interação de moléculas de proteína. Mas o problema é que as moléculas de proteína também são grandes. As proteínas também são moléculas poliméricas com grande peso molecular: geralmente de 10 a várias centenas de quilodaltons. E construir processos vitais básicos sobre eles é bastante problemático, porque são bastante sensíveis às mudanças de temperatura e do ambiente externo. E é provavelmente por isso que quase todos os processos vitais em uma célula são realizados através de pequenas moléculas. E a transformação de pequenas moléculas umas nas outras já é controlada pelas proteínas. O peso molecular destas pequenas moléculas é de várias dezenas a várias centenas de quilodaltons. Todas as pequenas moléculas encontradas em um organismo vivo são chamadas de metabólitos.
1 dalton, ou 1 unidade de massa atômica (amu)- uma unidade de massa extra-sistema usada para as massas de moléculas, átomos, núcleos atômicos e partículas elementares.
1 a. unidades = 1,660 539 066 60 (50) ⋅10−27 kg.
Os metabólitos primários são substâncias químicas encontradas em todas as células do corpo e necessárias para a manutenção dos processos vitais.Todas as moléculas de polímero, proteínas eácidos nucleicos. Esses metabólitos são iguais para todas as células de um organismo. Durante a vida, os metabólitos são convertidos uns nos outros, por exemplo, para fins de transferência de energia. E esses caminhos de transformação – cadeias de transformação – são chamados de caminhos metabólicos.
O ciclo de Krebs, ou ciclo do ácido tricarboxílico, é responsável pelo processo de respiração celular.
Diferentes vias metabólicas no corpo humano se cruzam, ou seja, eles têm participantes comuns.Assim, todos os processos que ocorrem com os metabólitos estão interligados.
Os metabólitos secundários são substâncias que não são necessárias para que todas as células assegurem suas funções vitais.Eles geralmente são usados para se adaptar às condiçõesambiente externo. Por exemplo, os cafeeiros produzem cafeína para proteger suas folhas de pragas. Eles são tóxicos para os besouros que comem as folhas do cafeeiro. Mas se de alguma forma removermos toda a cafeína da planta, ela continuará viva. Nenhum processo vital será interrompido. O segundo exemplo são os antibióticos. Você sabe que a penicilina é o primeiro antibiótico e foi isolada de forma completamente acidental de fungos, o que revolucionou a medicina. Os fungos usam penicilina para limpar seu espaço vital. É inofensivo para o organismo parental, mas tóxico para outros microrganismos. Na verdade, as pessoas usam essa propriedade para tratar diversas infecções bacterianas. Devido ao fato de os humanos consumirem ativamente plantas como alimento, nosso corpo é densamente povoado por vários microrganismos que formam a microflora. Essas substâncias são metabólitos secundários não apenas da própria pessoa, mas também de organismos vivos que inevitavelmente entram em nosso corpo.
O filtro natural e por que está errado
Os xenometabólitos são antibióticos, compostos que não estão associados à atividade de organismos vivos.Geralmente é algo que uma pessoa recebeuartificialmente para diferentes fins. Por exemplo, medicamentos, aditivos alimentares, suplementos dietéticos, doping, drogas, produtos de combustão de tabaco, álcool ou produtos de higiene, produtos químicos domésticos, ecotóxicos. Estas também são moléculas pequenas e entram no corpo tanto intencionalmente, no caso de drogas, quanto acidentalmente. Por exemplo, você escovou os dentes, engoliu pasta de dente - e foi assim que novos produtos químicos entraram em seu sistema. E muitas destas substâncias podem ter certos efeitos no nosso corpo, mesmo em concentrações muito pequenas. Além disso, este efeito pode ser positivo ou negativo ou variar dependendo da quantidade desta substância.
O fígado é a primeira barreira à entrada de substâncias químicas estranhas na circulação sistêmica.Ele tenta filtrar moléculas queo corpo será prejudicado e os removerá, impedindo que sejam liberados ainda mais pela corrente sanguínea até os órgãos. O fígado possui muitos mecanismos de filtração, mas nenhum deles funciona 100%: caso contrário, não haveria envenenamento e sérias consequências ao tomar quaisquer toxinas ou medicamentos. Porém, o fígado aproveita o fato de nosso corpo ser composto em grande parte por água, ou seja, é composto por 80% de água. Portanto, o fígado tenta separar as moléculas em hidrofílicas, que se dissolvem em água, e hidrofóbicas. O fígado “acredita” que se a substância for hidrofílica pode ser posteriormente liberada na circulação sistêmica, pois não deve causar muitos danos. E se uma substância é hidrofóbica, então algo precisa ser feito com ela para evitar que seja liberada ainda mais ou pelo menos para torná-la mais hidrofílica.
O fígado tem dois mecanismos - fases metabólicas.Na primeira fase, o fígado tentaproteínas e enzimas especiais da família do citocromo P450 oxidam essas substâncias. Como resultado da oxidação, a estrutura da molécula muda e ela pode tornar-se mais hidrofílica. O fígado pode então liberar esses metabólitos na corrente sanguínea ou tentar removê-los pelos rins, pela urina ou pelos intestinos. Se isso não funcionar, o fígado pode “costurar” moléculas já prontas e garantidamente solúveis em água nessas moléculas oxidadas.
O metabolismo hepático aumenta a diversidade de pequenas moléculas que podem acabar no nosso corpo.Por exemplo, na fase de oxidação, mais de 500 novas moléculas diferentes são teoricamente formadas a partir de uma molécula; não é possível prever quais delas são formadas e quais não são.
O alfabeto infinito: por que é tão difícil estudar metabólitos
Os ácidos nucléicos podem ser representados como um alfabeto de cinco letras a partir do qual uma grande sequência de texto é construída.Sim, claro, a sequência de letras nesteA linhagem pode ser relativamente caótica, embora durante a vida o DNA não mude, mas seja simplesmente copiado. Portanto, temos certas restrições sobre o que será essa string. No caso das proteínas, a situação é um pouco mais complicada: já serão 20 letras no alfabeto, ou seja, 20 aminoácidos a partir dos quais as proteínas são construídas, mas isso também acontece involuntariamente. Portanto, do ponto de vista do pesquisador, esses objetos também são bastante semelhantes entre si. E no caso dos metabólitos, é extremamente problemático destacar qualquer alfabeto: na verdade, esta é toda a tabela periódica. E entre as regras de formação está apenas a regra da valência. Além disso, existe uma característica da química do carbono que permite que dois átomos de carbono se liguem entre si e, posteriormente, adicionem um número ilimitado de átomos de carbono ou outros átomos da tabela periódica, o que dá origem a uma enorme diversidade química de tais moléculas.
Para estudar essas moléculas pequenas e toda sua variedade, são necessários métodos especiais.Existem alguns simples:por exemplo, uma análise organoléptica, que todos que fizeram um exame geral de sangue ou urina e viram que há uma linha “cheiro, cor” na direção encontraram. Quando é necessário encontrar uma molécula específica em uma solução, é adicionada uma gota de um reagente pré-selecionado. Se houvesse uma molécula na solução, ocorreria coloração; caso contrário, apareceria apenas um precipitado. Entre os métodos simples está também a espectroscopia óptica, quando é possível usar um microscópio para tirar conclusões sobre a estrutura do sedimento. Muito populares agora são os métodos imunoquímicos: este é o mesmo teste ELISA para COVID-19.
Estudos ômicos são aqueles estudos que estudam uma população completa.E a metabolômica implica a análise de grandesdados que representam o conjunto completo de pequenas moléculas em um organismo, célula ou órgão. O conjunto desses dados varia de acordo com várias estimativas de vários milhares, se considerarmos apenas os metabólitos primários, a várias dezenas de milhares, se adicionarmos a eles metabólitos secundários de plantas, bactérias e fungos conhecidos. Na verdade, até várias centenas de milhões, se levarmos em consideração toda a diversidade química que pode entrar no corpo humano. E para estudá-los, são necessários métodos especiais: espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e espectrometria de massa.
Ao longo dos 80 anos de história da RMN, os cientistas envolvidos neste método receberam cinco prêmios Nobel.Quatro - para RMN e o quinto - paraimagem de ressonância magnética. Um método ligeiramente diferente da espectroscopia de RMN, mas muito semelhante em princípio. O método NMR baseia-se no fato de que alguns átomos da tabela periódica possuem um momento magnético diferente de zero. Eles são pequenos ímãs e podem interagir com um campo magnético externo. Essa interação se manifesta na divisão dos níveis de energia. O método NMR permite distinguir entre diferentes átomos e átomos do mesmo elemento, mas em ambientes diferentes. Recentemente, a RMN vem perdendo popularidade, principalmente devido ao seu alto custo.
Como fazer partículas carregadas de uma mistura complexa e descobrir sua composição
A espectrometria de massa é um método de separação de partículas carregadas interagindo com um campo eletromagnético.Se tomarmos uma mistura complexa consistindo dediferentes partículas carregadas, e quase qualquer molécula com métodos modernos de espectrometria de massa pode ser convertida em uma forma carregada adicionando um próton a ela ou removendo um próton dela e aplicando um campo eletromagnético a esta mistura, então as partículas neste campo começarão para se mover e eles terão velocidade ou uma trajetória dependendo da massa. Partículas leves chegarão ao detector mais cedo do que as pesadas. Após o processamento dos dados do detector, é obtido um espectro de massa, no qual ao longo do eixo Y estará a intensidade do sinal, que é proporcional ao número de íons, e ao longo do eixo X - a massa nos íons, ou melhor, a razão entre massa e carga. Além disso, a espectrometria de massa permite medir a massa com altíssima precisão. Isso significa que é possível estabelecer inequivocamente a composição elementar do íon, das partículas carregadas ou da molécula a partir da qual foi formado. Matematicamente, isso é chamado de resolução da equação Diofantina em números inteiros: na verdade, esta é uma seleção de coeficientes próximos a cada átomo: m(C), m(H), k(O), z(N). E apenas uma combinação de inteiros m, n, k, z pode fornecer a massa medida pelo espectrômetro de massa.
O método da espectrometria de massa foi proposto no início do século XX por Thompson.Cientistas montaram o primeiro espectrômetro de massa do mundo ecom sua ajuda fez uma grande descoberta: confirmou experimentalmente a existência de isótopos. Por outro lado, ele não foi capaz de dar uma interpretação correta dos seus resultados. Seu aluno William Aston fez isso por ele: em 1922 recebeu o Prêmio Nobel por esta descoberta. No século 20, devido a uma série de guerras mundiais, a espectrometria de massa desenvolveu-se como um método para os militares. No início de seu desenvolvimento, encontrou sua principal aplicação na indústria nuclear. Como a espectrometria de massa pode separar substâncias por massa e determinar isótopos, ela pode ser usada para separar isótopos como o urânio. Mais dois prêmios Nobel foram concedidos à espectrometria de massa: em 1989 - Wolfgang Paul e Hans Dehmelt, e depois em 2002 - uma verdadeira revolução foi realizada de forma independente por John Fenn e Kaishi Tanaka. Eles propuseram um método próprio que permite obter uma partícula carregada a partir de uma grande molécula polimérica: de proteínas ou de ácidos nucléicos, sem destruí-la. Isso deu impulso ao estudo. Agora, nenhum laboratório - laboratório bioquímico ou de biologia molecular - pode operar sem seu próprio espectrômetro de massa ou sem um centro de uso compartilhado bem equipado no instituto.
Tendo determinado a massa de um íon, podemos apenas determinar a composição elementar, mas não a estrutura das moléculas.Porque uma composição elementar de diferentes estruturas pode corresponder a um grande número. Ou seja, os átomos de uma molécula podem ser organizados de diferentes maneiras. Isso é chamado de fenômeno do isomeria.
Os espectrometristas de massa descobriram uma maneira de obter um pouco mais de informações sobre a estrutura de uma molécula: um certo obstáculo é colocado no caminho das moléculas aceleradas que voam.Geralmente são moléculas de gás.Quando as moléculas colidem com essas moléculas de gás, elas podem se separar devido à colisão. E então o espectrômetro de massa mede a massa não da molécula original, mas dos pedaços em que ela se desfez. E esse decaimento não ocorre aleatoriamente, mas ao longo das ligações mais fracas da molécula. Os fragmentos resultantes são idênticos e são impressões digitais moleculares: únicas para cada molécula.
A cromatografia é um método de separação de substâncias com base em sua interação com sorventes.Sorventes são algo que pode absorveroutros produtos químicos, e o mais simples é o carvão ativado, que tomamos quando envenenamos. No início do século 20, o cientista russo Mikhail Tsvet demonstrou que se esse corante natural for passado por uma coluna cheia de giz, então, em vez de uma grande mancha verde manchada, você obterá várias manchas multicoloridas: do amarelo ao verde. Assim, ele, em primeiro lugar, percebeu que o corante verde das folhas é uma mistura de diferentes substâncias. E, em segundo lugar, ele descobriu a cromatografia, pela qual, em 1952, outros cientistas que trouxeram seu método para alguma forma moderna receberam o Prêmio Nobel. Na cromatografia moderna, uma mistura é passada através de uma coluna utilizando um líquido ou gás, dependendo do tipo de cromatografia. O líquido “arrasta” as moléculas para frente, em direção à saída da coluna, e o sorvente interfere em cada molécula de diferentes maneiras. Eles acabam saindo da coluna em momentos diferentes, o que pode ser registrado e utilizado como mais uma impressão digital para identificação.
Do exame do líquido cefalorraquidiano ao método do sangue seco
A espectrometria de massa é o único método atualmente disponível para estudar o líquido cefalorraquidiano.Em alguns casos difíceis de diagnósticodoenças, é necessária uma punção, a coluna é perfurada e uma amostra de líquido cefalorraquidiano é coletada. Mas o problema é que, em média, uma pessoa tem apenas 120 ml de líquido cefalorraquidiano. E esse líquido está sob pressão, então tomar até 1 ml afeta significativamente essa pressão e pode levar a consequências irreversíveis para o corpo. Portanto, na realidade, apenas alguns microlitros podem ser amostrados. Nenhum dos métodos existentes, exceto a espectrometria de massa, pode lidar com quantidades tão pequenas de amostras, porque quanto menor a amostra, menos moléculas ela possui e mais sensível seu equipamento precisa ser. A sensibilidade da espectrometria de massa geralmente é suficiente para isso. Após a coleta, a amostra é retirada de inclusões mecânicas e proteínas para evitar quebras do equipamento. Após a análise, o resultado é processado em um computador e uma “lista de recursos” é obtida: a saída é de aproximadamente 10 a 15 mil linhas. As colunas produzem uma fórmula que definimos com uma massa exata, uma intensidade proporcional à quantidade daquela molécula e uma “impressão digital”.
O método mais direto de aplicar issoexperimento de espectrometria de massa metabolômica - comparando pessoas doentes e saudáveis para identificar quais moléculas aparecem, aparecem e mudam de concentração quando ocorre tal diferença.Geralmente existem dois grupos:pessoas saudáveis e pessoas com uma doença que nos interessa, por exemplo, com uma forma específica de oncologia. Para cada amostra, essas placas são obtidas e os matemáticos as comparam e visualizam para encontrar diferenças entre elas.
A primeira aplicação da espectrometria de massa é na triagem neonatal.Cada recém-nascido, por portaria do Ministério da Saúde com2006, eles são obrigados a testar um determinado conjunto de doenças hereditárias. Agora, de qualquer forma, em Moscou eles testam pelo menos 16 doenças diferentes. Existem essas doenças, e muitas vezes se manifestam desde os primeiros minutos de vida, que, se não forem interrompidas a tempo, em uma semana ou alguns dias, podem deixar a criança incapacitada para o resto da vida. Portanto, tal diagnóstico deve ser feito nas primeiras horas de vida do recém-nascido. Os biomarcadores de quase todas essas doenças são metabólitos de pequenas moléculas. Ou seja, as doenças se manifestam na forma de perturbações do metabolismo, por exemplo, o acúmulo de certos ácidos orgânicos ou de certos lipídios no sangue. E, naturalmente, esse acúmulo ocorre em concentrações muito pequenas, a partir delas é preciso reconhecer a diferença nas alterações do metabolismo. Portanto, além da espectrometria de massa, nenhum outro método funcionará aqui.
Para resolver o problema da coleta de sangue de crianças (não uma quantidade tão grande de sangue e o medo das crianças de métodos invasivos e de médicos), eles criaram uma tecnologia para analisar manchas de sangue seco.É feito um pequeno furo e um ou maisduas gotas de sangue diretamente em um pequeno pedaço de papel de filtro. O volume de sangue aqui é de vários microlitros. Em seguida, esse cartão é seco e enviado ao laboratório, e o envio também é muito prático: a amostra não precisa ser congelada ou descongelada. Basta dissolver novamente este cartão para análise e em poucas horas a análise estará pronta.
Outra área de aplicação da espectrometria de massa é a medicina personalizada.Todas as nossas substâncias vão para o fígado, e o fígadode alguma forma os metaboliza. Além disso, o nosso fígado funciona de forma diferente para todos nós, não apenas por causa de algumas doenças ou maus hábitos. Por exemplo, o suco de toranja pode afetar significativamente o seu metabolismo; inibe algumas enzimas e, como resultado, a concentração de alguns medicamentos pode ser várias vezes maior do que o esperado. Algumas pessoas terão essa concentração no sangue após tomar o medicamento, enquanto outras terão o dobro da concentração. Acontece que a dosagem precisa ser reduzida à metade para não causar danos desnecessários ao organismo. Daí a transição para a medicina personalizada. Você toma um comprimido, seu sangue é tirado de hora em hora e eles olham a curva: como a substância viaja pelo seu corpo ao longo do tempo, qual é a sua concentração no sangue. Aí o médico pode ajustar a dosagem ou até mesmo interromper o medicamento e prescrever outro. E, neste caso, a análise de sangue seco também é usada de forma muito ativa.
Qualquer novo medicamento que entre no mercado passa necessariamente por uma etapa de pesquisa metabólica.Algumas drogas podem não ser muito tóxicas,mas como resultado de um colapso no fígado e de alguns erros, essas substâncias podem se tornar ainda mais tóxicas. O exemplo mais simples é o paracetamol. As instruções do paracetamol dizem que não deve ser administrado a crianças pequenas. Que as crianças pequenas só devem receber ibuprofeno. E a razão para isso é o acúmulo dessa molécula no fígado, que, por conta do metabolismo, tem efeito tóxico. Para um adulto com fígado bem desenvolvido, esse efeito tóxico não é muito perceptível, embora, é claro, você também não deva engolir paracetamol em potes. Para as crianças pequenas, isso, de fato, pode levar a todo tipo de consequências desagradáveis e até irreversíveis. Portanto, todo novo medicamento deve ser estudado quanto ao metabolismo.
A imagem é uma forma de conduziranálise espectrométrica de massa, quando obtemos informações não apenas sobre uma amostra homogênea, mas também sobre uma amostra heterogênea, e podemos estudar sua composição molecular no espaço.Existe um exemplo tão interessante para estudardistribuição da droga e seus metabólitos no corpo do rato. O experimento é realizado da seguinte forma: um rato recebe um determinado medicamento, após algumas horas o animal é sacrificado e, em seguida, o animal é finamente cortado ao longo de todo o corpo. E então uma técnica especial de espectrometria de massa permite estudar a composição molecular de cada ponto nesta amostra. Após o processamento do computador, é possível visualizar onde quais metabólitos se acumularam. É importante estudar a distribuição dos metabólitos, porque se você estiver tomando um medicamento para pneumonia, é importante que ele vá para os pulmões e não para o cérebro. Um bisturi espectrométrico de massa é uma "faca" que bombeia moléculas para fora do local da incisão e, então, usando a tecnologia da computação, é possível determinar qual cirurgião está cortando o tecido: doente ou saudável. Este método está agora sendo introduzido nos Estados Unidos, e a primeira operação real com tal faca já foi realizada.
Impressões digitais para cada molécula
O problema é que várias centenas ou mesmo milhares de compostos químicos podem corresponder a uma composição elementar.Portanto é necessário identificar todas as linhastabelas, e esta é a principal tarefa da análise metabolômica moderna; infelizmente, não foi totalmente resolvida. As impressões digitais moleculares são comparadas com aquelas encontradas em bancos de dados de moléculas químicas. Se corresponderem, podemos dizer com alguma confiança que esta é a molécula certa. Mas essas bases de dados contêm um número muito limitado de substâncias. O banco de dados completo de impressões digitais contém cerca de 20 a 30 mil compostos; nem sequer cobre todos os metabólitos primários e secundários que estão presentes no corpo humano. Há outro problema: para reabastecer esse banco de dados, é necessária uma substância química pura, e elas geralmente são caras. Ou seja, um produto químico puro geralmente custa dezenas ou centenas de dólares.
Uma abordagem para a identificação é criar novas impressões digitais.Por exemplo, o método está agora sendo desenvolvido ativamenteespectrometria de mobilidade iônica. Enquanto a espectrometria de massa divide os íons por massa, a mobilidade iônica permite que eles sejam separados por tamanho. Ou seja, se você tiver dois corredores - não um pesado e um leve, mas um grande e um pequeno, e colocar algum tipo de obstáculo no caminho deles - por exemplo, uma rede com células, então um atleta esguio irá rasteje rapidamente por essa rede e alcance a linha de chegada, mas um gordo irá. Até sair dessa rede, ele virá correndo depois de algum tempo.
O segundo método é tentar encontrar impressões digitais que não requeiram padrões limpos para serem identificadas.No laboratório propomos usar a chamada troca de isótopos.
Por exemplo, se olharmos para tal molécula, entãoveremos que ele possui átomos de hidrogênio associados ao oxigênio. Então, eles são especiais. Eles podem deixar essa molécula e retornar a ela. Se tivermos essa molécula dissolvida em água, o hidrogênio pode deixar a molécula e o hidrogênio pode retornar da água. E se tomarmos não apenas água, mas água pesada, onde em vez de hidrogênio há deutério, então o hidrogênio pode deixar a molécula e o deutério pode tomar seu lugar. O deutério é conhecido por diferir do hidrogênio no peso molecular por unidade, e um espectrômetro de massa pode ver essa mudança. Simplesmente contando o número de tais hidrogênios, pode-se dizer se esta é uma molécula necessária ou desnecessária, se a identificamos corretamente ou não.
A inteligência artificial pode ser usada para identificar moléculas.Com base nas informações disponíveis, você pode preencherbancos de dados de informações ausentes usando métodos de aprendizagem profunda. Ou seja, treinamos o modelo, e ele prevê as impressões digitais necessárias com base na estrutura da molécula, que podemos então usar para comparar com o que foi obtido no experimento.
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