Aplicarea ingineriei genetice în cercetarea științifică
- Knockout genic
Pentru a studia funcția unuia sau altuia
Pentru knockout, aceeași genă sau fragmentul ei este sintetizată, modificată astfel încât produsul genic să-și piardă funcția. Principalele metode de implementare: zinc finger, morpholino și TALEN.
Pentru a obține șoareci knockout, cei obținuțiConstructul modificat genetic este introdus în celulele stem embrionare, unde constructul suferă recombinare somatică și înlocuiește gena normală, iar celulele modificate sunt implantate în blastocistul mamei surogat. În musca fructelor, mutațiile Drosophila sunt inițiate la o populație mare, în care sunt căutați descendenți cu mutația dorită. Plantele și microorganismele sunt eliminate în mod similar.
- Expresie artificială
O adăugare logică la knockout esteexpresie artificială, adică adăugarea unei gene la corp pe care nu o avea înainte. Această tehnică de inginerie genetică poate fi utilizată și pentru a studia funcția genelor. În esență, procesul de introducere a genelor suplimentare este același ca și pentru knockout, dar genele existente nu sunt înlocuite sau deteriorate.
- Vizualizarea produsului genetic
Folosit atunci când sarcina este de a studialocalizarea produsului genic. Una dintre metodele de marcare este înlocuirea genei normale cu una fuzionată cu un element reporter, de exemplu, cu gena proteinei fluorescente verde GFP. Această proteină, care are fluorescență în lumină albastră, este folosită pentru a vizualiza produsul modificării genetice.
Deși această tehnică este convenabilă și utilă, efectele sale secundareconsecințele pot fi pierderea parțială sau completă a funcției proteinei studiate. O metodă mai sofisticată, deși nu atât de convenabilă, este de a adăuga la proteina în studiu oligopeptide atât de mari care pot fi detectate folosind anticorpi specifici.
- Investigarea mecanismului de exprimare
În astfel de experimente, sarcina este de a studiacondiţiile de exprimare a genelor. Caracteristicile expresiei depind în primul rând de o mică bucată de ADN situată în fața regiunii de codificare, numită promotor, care servește la legarea factorilor de transcripție.
Acest site este introdus în corp prin plasarea dupăîn loc de propria genă reporter, de exemplu, GFP sau o enzimă care catalizează o reacție ușor de detectat. Pe lângă faptul că funcționarea promotorului în anumite țesuturi la un moment dat sau altul devine clar vizibilă, astfel de experimente fac posibilă studierea structurii promotorului prin îndepărtarea sau adăugarea de fragmente de ADN la acesta, precum și îmbunătățirea artificială funcțiile sale.
De ce este nevoie de ingineria genetică umană?
Atunci când este aplicat la oameni, ingineria genetică ar puteafolosit pentru tratarea bolilor ereditare. Cu toate acestea, din punct de vedere tehnic, există o diferență semnificativă între tratarea pacientului însuși și modificarea genomului descendenților săi.
Sarcina de a schimba genomul adultuluieste ceva mai complicată decât reproducerea de noi rase de animale modificate genetic, deoarece în acest caz este necesar să se schimbe genomul numeroaselor celule ale unui organism deja format și nu doar un ou embrionar. Pentru a face acest lucru, se propune utilizarea particulelor virale ca vector.
Particulele virale sunt capabile să pătrundă înun procent semnificativ de celule adulte, înglobând informațiile lor ereditare în ele; reproducerea controlată a particulelor virale în organism este posibilă. În același timp, pentru a reduce efectele secundare, oamenii de știință încearcă să evite introducerea de ADN modificat genetic în celulele organelor genitale, evitând astfel impactul asupra viitorilor descendenți ai pacientului.
De asemenea, este demn de remarcat critica semnificativă a acestei tehnologii în mass-media: dezvoltarea virusurilor modificate genetic este percepută de mulți ca o amenințare pentru întreaga umanitate.
Cu ajutorul terapiei genice, este posibilă în viitor schimbarea genomului uman. În prezent, metode eficiente de modificare a genomului uman sunt în stadiul de dezvoltare și testare pe primate.
Ingineria genetică de lungă durată a maimuțelors-a confruntat cu dificultăți serioase, dar în 2009 experimentele au fost încununate de succes: în revista Nature a apărut o publicație despre utilizarea cu succes a vectorilor virali modificați genetic pentru a vindeca un mascul adult de daltonism.În același an, primul primat modificat genetic (crescut dintr-un ou modificat) a dat naștere la urmași.- marmoset comun (Callithrix jacchus).
Deși la scară mică, ingineria genetică a făcut-o dejafolosit pentru a oferi femeilor cu anumite tipuri de infertilitate șansa de a rămâne însărcinate. Ovulele de la o femeie sănătoasă sunt folosite pentru aceasta. Ca urmare, copilul moștenește genotipul de la un tată și două mame.
Cu toate acestea, posibilitatea de a introduce mai semnificativemodificările genomului uman se confruntă cu o serie de probleme etice grave. În 2016, un grup de oameni de știință din Statele Unite au primit aprobarea pentru studiile clinice ale unei metode de tratament al cancerului folosind propriile celule imune ale pacientului, care sunt modificate genetic folosind tehnologia CRISPR / Cas9.
La sfârșitul anului 2018, doi copii s-au născut în China,al cărui genom a fost modificat artificial (gena CCR5 a fost dezactivată) în stadiul embrionar folosind metoda CRISPR/Cas9, ca parte a cercetărilor efectuate din 2016 pentru combaterea HIV. Unul dintre părinți (tatăl) era infectat cu HIV, iar copiii, conform declarației, s-au născut sănătoși.
Deoarece experimentul a fost neautorizat (înaintePrin urmare, toate astfel de experimente pe embrioni umani au fost permise numai în primele etape de dezvoltare, cu distrugerea ulterioară a materialului experimental, adică fără implantarea embrionului în uter și nașterea copiilor), savantul responsabil pentru aceasta a făcut-o. nu oferă dovezi pentru declarațiile sale, care au fost făcute la o conferință internațională privind editarea genomului.
La sfârșitul lunii ianuarie 2019, autoritățile chineze au confirmat oficial faptele acestui experiment. Între timp, savantului i s-a interzis să se angajeze în activități științifice și a fost arestat.
Cum este modificat genomul uman?
- Metoda degetelor de zinc
„Degete de zinc” se regăsesc și în compozițieproteine umane. Datorită acestei metode, este posibil să se proiecteze lanțul ZFN astfel încât să recunoască o secțiune specifică a ADN-ului. Acest lucru face posibilă vizarea unor zone specifice din cadrul genomurilor complexe.
Domeniile degetelor de zinc se găsesc înfactori de transcripție umani - proteine care reglează procesul de sinteză a ARN-ului cu șablonul ADN. Când se creează nucleaze artificiale, este posibil să se construiască un lanț de „degete de zinc”, astfel încât să recunoască o anumită secțiune a ADN-ului.
Dacă un astfel de lanț este suficient de lung, acesta estepoate recunoaște secvențe de ADN relativ extinse constând dintr-un număr de fragmente de trinucleotide. Aceasta înseamnă o posibilitate reală de impact direcționat asupra unor zone specifice din cadrul unor genomi mari complexe.
Cu toate acestea, a dezvăluit și metoda „degetului de zinc”.dezavantaje serioase: în primul rând, aceasta nu este o recunoaștere foarte strictă a repetărilor trinucleotidelor, ceea ce duce la un număr vizibil de clivaj ADN în regiunile „non-țintă”.
În al doilea rând, metoda sa dovedit a fi foarte laborioasă șicostisitoare, deoarece pentru fiecare secvență de ADN este necesar să se creeze propria structură proteică optimizată a nucleozelor cu degetul de zinc. Prin urmare, sistemul „degetele de zinc” nu este răspândit.
- TALEN
În 2011, revista Nature Methods a denumit sistemulTALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) „metoda anului” datorită unei game largi de aplicații posibile în diferite domenii ale științei fundamentale și aplicate.
TALEN este una dintre metodele de aplicare vizatăspargerea ADN-ului cu „vindecarea” ulterioară - pentru a opri genele la șoareci. Imediat după acestea, această tehnologie a fost utilizată pentru a introduce o mutație în genomul șoarecelui, ducând la dezvoltarea unuia dintre sindroamele ereditare. Autorii metodei de modelare a bolilor determinate genetic au reușit nu numai să „strice” genomul șoarecelui, ci și să îl corecteze înapoi.
- CRISPR / Cas9
Metoda oferă un efect precis asupra anumitor regiuni de ADN și poate fi utilizată în aproape orice laborator biologic molecular modern.
Acest sistem se bazează pe zone specialeADN bacterian - CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats, sau scurte palindromic cluster repeats). Aceste repetări sunt separate de distanțieri - fragmente scurte de ADN străin. Acestea din urmă sunt încorporate în genom după ce ADN-ul se recombină cu genomul său.
Exemple de editare umană
- Editarea genomului chiar în corp
Boala Brian, în vârstă de 44 de ani, rezident în ArizonaMado s-a manifestat în copilăria timpurie. Este incurabil și este moștenit în principal de bărbați. Mucopolizaharidoza de tip II este o tulburare metabolică: persoanele cu aceasta prezintă o mutație într-o genă responsabilă de producerea unei enzime care este implicată în descompunerea carbohidraților complecși. Ca urmare, acestea se acumulează în celule și provoacă numeroase patologii ale organelor.
Bărbatul a decis să participe la clinicătestarea unei noi metode - terapia genică. Aceasta este doar prima fază a studiului, iar înainte de înregistrarea terapiei (adică înainte de permisiunea de a utiliza această metodă pentru toți pacienții cu sindrom Hunter), trebuie să existe trei dintre aceștia.
Metoda folosită în cazul lui BrianMado vă permite să editați genomul direct în corpul uman - și, în același timp, să vizați cu precizie o anumită secțiune a ADN-ului. Editarea are loc folosind așa-numitele „degete de zinc”.
- Copii modificati genetic
Cercetătorul chinez He Jiankui a editat genomul embrionilor umani înainte de fertilizarea in vitro, rezultând doi copii cu ADN modificat.
Cercetător sistem CRISPR / Cas9a editat genomul a șapte embrioni de cupluri în timpul tratamentului de reproducere. Ca urmare a uneia dintre sarcini, două fete gemeni cu ADN modificat s-au născut dintr-o mamă sănătoasă și un tată infectat cu HIV. El Jiankui a explicat că a îndepărtat gena CCR5 de la copii, ceea ce le-a conferit imunitate pe tot parcursul vieții la HIV.
- Revenirea vederii cu terapia genică
Pentru restabilirea vederii, pot fi folosite tehnologii optogenetice, cu ajutorul cărora activitatea neuronilor poate fi controlată cu ajutorul proteinelor sensibile la lumină ale bacteriilor și a blițurilor laser.
Ghidați de această idee, biologii au creat un virus,care poate pătrunde în neuronii ganglionari. Aceste celule nervoase sunt responsabile pentru transmiterea semnalelor din retină către creierul uman. Un virus care intră în nevroza ganglionară îl face să producă molecule de semnalizare similare. Cu toate acestea, această procedură nu restabilește viziunea de la sine, deoarece proteinele bacteriilor reacționează la lumină diferit de tijele și conurile retinei.
Pentru a rezolva această problemă, profesorul de la BaselProfesorul Universității Botond Rosca și Universitatea din Pittsburgh, José Sahel, au creat ochelari speciali care transformă imaginea primită într-un format ușor de înțeles pentru creier și stimulează celulele ganglionare cu blițuri laser. Ca urmare, pacientul poate vedea siluetele obiectelor și obiectelor mari și poate efectua alte acțiuni complexe.
Citeste mai mult:
Oamenii de știință au testat teoria panspermiei pe tardigrade: pot călători în spațiu
Oamenii de știință au descoperit că aurul super-îmbogățit se formează ca iaurt
Micul motor cu hidrogen înlocuiește omologii cu combustibili fosili