Dmitry Madera - vedúci oddelenia molekulárnej genetiky na BIOCAD, docent na SPUFU, Ph.D.
V roku 2002 absolvoval Fakultu biológie Moskovskej štátnej univerzityodbor genetika. Obhájil dizertačnú prácu pre doktorát fylosofie v biológii o programe štúdia funkcie a génovej expresie na University of Massachusetts, potom pracoval na Národných ústavoch zdravotníctva, študoval molekulárne aspekty vývoja rakoviny a ako ich ovplyvniť. V roku 2015 bol vedúcim laboratória molekulárnej genetiky na BIOCADe a od tej doby sa venuje vývoju produktov génovej terapie. Autor medzinárodného patentu popisujúceho novú nukleázu rodiny Cas9 a články v oblasti rozvoja rakoviny.
Experiment Jiankui, riziko onkológie u narodených dievčat a cielené mutácie
— Čo si myslíte o experimente čínskeho biofyzika He Jiankui, ktorý upravil genóm dvoch embryí? Odbornícipohľadávkaže narodené dievčatá môžu mať mutácie. Ako tomu zabrániť?— Po preštudovaní pôvodného zdroja (výskum MIT —"High-tech") a komentárom genetika Fjodora Urnova som si uvedomil, že médiá trochu skresľujú informácie. Áno, u dievčat je väčšia pravdepodobnosť, že budú mať mutácie. To sa týka tých mutácií, o ktorých nie je známe, kde presne sa vyskytnú. A teraz je ťažké presne určiť, kde vznikli náhodné mutácie v dôsledku vplyvu CRISPR / Cas9. Aby ste to dosiahli, musíte urobiť porovnanie s rodičmi dievčat.
Formálne je toto správne vyhlásenie:Cieľové mutácie skutočne môžu existovať. A nedá sa s tým nič robiť. A moderné metódy úpravy génov tomu nezabránia. Toto je vlastne problém, pretože to môže byť nebezpečné.
Na konci roku 2018 čínsky vedec He Jiankuioznámil, že bol schopný vytvoriť geneticky modifikované dvojčatá s vrodenou imunitou proti HIV. Povedal, že editoval embryá párov podstupujúcich IVF a jeden zo siedmich pokusov bol úspešný. Experiment vyvolal novú vlnu diskusií o etike zasahovania do ľudského genetického kódu.
Fedor Urnov, špecialista na úpravyGenóm Kalifornskej univerzity v rozhovore pre spoločnosť MIT Technology Review uviedol: „Tvrdenie, že reprodukuje prevládajúci CCR5, je očividným skreslením“ a dodal, že ho možno opísať iba ako „úmyselné skreslenie“.
Nová štúdia od MIT ukázala, že vedci niedokázali reprodukovať prevládajúcu verziu CCR5. Aj keď sa tím zameriaval na správny gén, vedci nekopírovali požadovanú variáciu Delta 32, ale namiesto toho vytvorili nové vydania, ktorých účinok nie je jasný - zatiaľ čo môžu spôsobiť mutácie.
Tvrdenie, že He Jiankui nebol schopný zmutovaťgén CCR5 (gén, ktorý umožňuje HIV infikovať ľudské bunky – Hi-Tech) je nesprávny. V skutočnosti dosiahol svoj cieľ a CCR5 bol skutočne zmutovaný a už nefunguje, čo znamená, že HIV nemôže infikovať bunky. Áno, zjavne nebol schopný reprodukovať špecifickú prirodzenú alelu nachádzajúcu sa v ľudských populáciách, ale napriek tomu je CCR5 „vyradený“ a nefunguje, čo znamená, že Jiankui dosiahol minimálny cieľ.
Ak chcete zabrániť cieľovým mutáciám,je potrebné zdokonaliť metódy úpravy genómu a zvýšiť ich presnosť. V budúcnosti bude teda možné znížiť riziko mutácií na úroveň pozadia a potom sa upokojiť tým, že k mutáciám dochádza prirodzene. Ako sa hovorí, nie je potrebné byť svätejší ako pápež.
- To znamená, že keď dospejú tieto dievčatá, bude nereálne presne pochopiť, aké mutácie mali v dôsledku akcií Jiankui?
- Keď hovoríme konkrétne o CCR5, potom samozrejme,je to možné. A pre celý genóm - v zásade je to teraz možné, ak zoberiete genetický materiál svojho otca a matky a porovnáte ho so svojím vlastným. Potom bude jasné, aké možnosti majú rodičia a ktoré z tých, ktoré sú prítomné v genóme dievčat, ani mama, ani otec. Ďalšia vec je, že nebude možné zistiť, ktoré mutácie vznikli v dôsledku CRISPR / Cas a ktoré náhodne. Môžete porovnávať iba frekvenciu týchto mutácií: koľko normálnych mutácií sa vyskytuje pri narodení a koľko z týchto dievčat. Ak bude viac rádu, potom je všetko jasné.
Technológia úpravy genómu CRISPR/Cas9 má potenciál eradikovať tisíce dedičných chorôb, ktoré boli predtým považované za nevyliečiteľné.
Hlavný rozdiel medzi génovým nástrojomeditácia CRISPR / Cas9 z iných, dostatočne dlhých existujúcich metód - to je možnosť smerových zmien DNA. CRISPR / Cas9 vám umožňuje špecificky ovplyvniť sekvenciu DNA a dokonca zmeniť zlomený gén na správny. Za týmto účelom špeciálny enzým, nukleáza, vytvára medzeru na správnom mieste v genóme, po ktorej sa aktivuje opravný systém - vnútorné mechanizmy bunky na obnovenie genómu. V tomto prípade je DNA v mieste prerušenia spravidla opravená náhodnými chybami, ktoré s najväčšou pravdepodobnosťou vedú k strate alebo vloženiu niekoľkých písmen v sekvencii a objaveniu sa mutácií. Preto hľadá ako vzorku požadovanú sekvenciu v susedných genómoch. Podľa technológie musí bunka nájsť túto sekvenciu v špeciálnych fragmentoch DNA. Ich genetika sa zaviedla do bunky, aby ju mohla vziať a samostatne ju zaviesť do seba. Náhodné mutácie v mieste pretrhnutia sa však vyskytujú omnoho častejšie ako reparácia smerovaná pozdĺž vzorky.
Ďalšia otázka, Konstantin Severinov (Rusšpecialista v oblasti molekulárnej biológie a CRISPR/Cas - Hi-Tech) svojho času vyslovil zaujímavú myšlienku, že ak by tam bolo niečo úplne strašné, dievčatá by jednoducho neprežili ani v štádiu embryogenézy. S najväčšou pravdepodobnosťou nebolo ovplyvnené nič zásadné o ich genóme. Jediné, čo ma desí, je onkológia. Naozaj dúfam, že nebudú mať podobné choroby.
- Prečo? Stáva sa onkológia pravdepodobnejšia v dôsledku úpravy ľudského genómu?
- Určite. Poďme sa pozrieť na príčiny rakoviny.Existujú tri z nich: dedičné mutácie, teda špeciálne alely, ktoré nesú pravdepodobnosť zvýšenia rizika rakoviny, ako napríklad Angelina Jolie; vírusové príčiny - napríklad ľudský papilomavírus; a náhodné mutácie. Práve výskytu mutácií posledného typu u dievčat z čínskeho experimentu sa obávam, najmä ak tam bola vysoká frekvencia mutácií. Potom je pravdepodobnosť výskytu nádorov akéhokoľvek typu odlišná od nuly.
Dmitrij Madera. Foto: Science Bar Hopping
Ako upraviť ľudský genóm, vedúce krajiny a osud ruskej genetiky
- Ako je ľahšie uskutočňovať takéto experimenty so zvieratami?
— Upraviť genóm každého zvieraťapotrebujete vlastný protokol. Musíte upraviť myš alebo kravu pomocou rôznych protokolov. A človek, podobne ako iné zviera, potrebuje jeho vývoj pre seba, aby mohol čo najefektívnejšie upraviť svoj genóm. Nedá sa teda povedať, že je ťažšie upraviť človeka ako kravu. Len to treba robiť inak ako s myšou či potkanom. Ale prístupy zostávajú rovnaké. U nás nie je nič veľmi odlišné.
- To jeproblém spočíva iba v oblasti etiky a práva? A ak by sa rozhodlo, bolo by viac experimentov?
- Nepochybne.A potom je tu vlastne pomerne veľa experimentov. Chodím na konferencie a často sa stretávam s kolegami. Napríklad Oregonská univerzita vykonáva vynikajúce experimenty s úpravou ľudského genómu a pestovaním embryí. Jednoducho sú následne zničené v určitom, ranom štádiu. Takéto experimenty nie sú zakázané. V skutočnosti je jediným obmedzením implantácia embrya a jeho kultivácia až do pôrodu.
- Ktoré krajiny sú dnes lídrami vo výskume úpravy ľudského genómu?
— Teraz sú medzi nimi a všetkými takí vodcovia dvajaostatné sú absolútna priepasť. Ide o USA a Čínu. Nikto nie je ešte bližšie, vo svojom výskume sú tak ďaleko od zvyšku sveta.
- Súvisí to s financovaním alebo vedeckou základňou?
- S oboma.Čína investuje veľa peňazí do výskumu, ich vládu to veľmi znepokojuje. A ak predtým jednoducho kopírovali technológiu, teraz čínski vedci robia zaujímavé veci. A v USA je jednoducho veľmi silná vedecká základňa. Vlastne, kde boli všetky tieto CRISPR/Cas objavené Väčšina objaviteľov tejto metódy, okrem Jennifer Doudna, sú Číňania, ale pracujú v USA? Preto medzi oboma krajinami existovala taká synergia.
— Čo bráni Rusku v rozvoji v tejto oblasti? Dokonca aj prezidentuviedolo priorite výskumu v smere genetiky.
- Poviem to, dnes už existuje financovanievýskum - je pridelených veľa peňazí. To sa však, samozrejme, nedeje za jednu hodinu. Potrebujeme vedeckú základňu a školu. V Rusku je z hľadiska genetiky po lyzenizme všetko smutné. Pred Lysenkom bola sovietska škola genetiky jednou z najlepších na svete. Vavilov išiel do Morganu (Thomas Morgan - jeden zo zakladateľov genetiky, laureát Nobelovej ceny - „High Tech“) a komunikovali za rovnakých podmienok. Po Lysenkovi bolo všetko barbarským spôsobom zničené. A odvtedy sa nemôžeme zotaviť. Áno, peniaze sú veľmi dôležité. Je však tiež potrebné, aby deti chodili študovať, aby boli zapojení zahraniční špecialisti. A ak bude existovať škola, v Rusku dôjde k genomickému strihu.
- Ako to ovplyvní nedávne odporúčania týkajúce sa komunikácie medzi ruskými a zahraničnými vedcami - nahlásiť všetky kontakty, prakticky na komunikáciu, ako v Sovietskom zväze?
- To je veľmi desivé. Najhoršia vec, ktorú možno pre ruskú vedu urobiť a úplne ju zabiť, sú tieto odporúčania. A chápem, že ide iba o odporúčania a nemusia sa dodržiavať. Ale ľudia sa obávajú. A začnú ich aktívne vykonávať. Najmä nie vedci, ale byrokrati z vedy. Začnú prestať komunikovať so zahraničnými vedcami. Poznám príbeh, keď vedecký manžel z Nemecka na nejakú konferenciu v Rusku nejaký čas prišiel a zahraniční vedci k nám často neprichádzajú a kvôli týmto požiadavkám im nebolo umožnené zúčastniť sa udalosti. Veda je medzinárodná a vy musíte čo najviac komunikovať a komunikovať s kolegami, a potom to bude dobré. Dôrazne odsudzujem tieto požiadavky.
Liečba hluchoty, nebezpečných chorôb a dodávky liekov
— Ruský genetik Denis Rebrikovísť doupraviť genóm embryí pre páry s poruchami sluchu. Aká je pravdepodobnosť úspechu takéhoto experimentu?
— Denis Vladimirovič vzal do úvahy všetky svoje chybyČínsky kolega. Urobí sekvenovanie celého genómu. A samotný experiment bude prebiehať v kontrolovanejšom prostredí, nie v polopodzemných podmienkach, ako to bolo v prípade Jiankui. Myslím si, že úspech je v zásade z metodologického hľadiska možný a ukazuje sa, že všetko nie je také strašidelné, najmä pri použití moderných metód. A úroveň mutácie môže byť na úrovni pozadia. Čo sa týka týchto chorých detí, áno, ide o monogénnu mutáciu a je dominantná, čiže je celkom ľahké ju zničiť, čo sa už genetikom darí. A v skutočnosti to je všetko, nič nestojí v ceste.
— Ako to zapadá do ruskej legislatívy?
- Pokiaľ ide o legislatívne aspekty, Rebrikovna tom to funguje. V tomto zmysle je veľmi zaujímavé vedieť, čo sa tam deje. Naozaj by som rád, keby sa mu podarilo prelomiť tento legislatívny múr. Aj keď jeho príklad a choroba, ktorú si vybral, podľa názoru mnohých mojich kolegov a moja nie sú také relevantné. Pole sa však otvára obrovské, takže nech je prvé a má dobrý výsledok. Ďalej bude možné rozšíriť „repertoár“.
- Aké ďalšie nebezpečné choroby možno liečiť pomocou CRISPR / Cas?
— Samozrejme, cystická fibróza je veľmi vážnachoroba. Pri liečbe Duchennovej svalovej dystrofie je možné využiť úpravu génov, aspoň u niektorých pacientov, ktorí majú mutáciu na to viac či menej vhodnú. Vo všeobecnosti existuje viac ako 10 tisíc monogénnych genetických chorôb a tu je otázka, ktorá metóda je vhodnejšia a jednoduchšia na liečbu. Napríklad spinálna svalová atrofia by sa nemala liečiť úpravou, ale jednoducho terapiou náhrady génov.
Cystická fibróza- systémové dedičné ochorenie,spôsobené mutáciou v géne pre transmembránový regulátor cystickej fibrózy a charakterizované poškodením exokrinných žliaz a ťažkou dysfunkciou dýchacích orgánov. Cystická fibróza je mimoriadne zaujímavá nielen pre jej rozšírenú prevalenciu, ale aj preto, že bola jednou z prvých dedičných chorôb, ktoré sa liečili. Cystická fibróza bola prvýkrát uznaná ako samostatná entita Dorothy Andersenovou v roku 1938.
Duchennova myodystrofia- spôsobené vymazaním alebo zdvojením jednéhoalebo niekoľko exónov alebo bodových mutácií v géne pre dystrofín. Hlavným prejavom je svalová slabosť, ťažkosti s pohybom od detstva, ktoré časom progredujú. Smrť zvyčajne nastáva v druhej alebo tretej dekáde života. Jeho priemerná dĺžka života je 25 rokov, no sú ľudia, ktorí žijú dlhšie.
- Kedy budú vedci schopní to urobiť? Aký je časový rozsah?
- Pozri, zvieratá sa už liečia.Pravda, najprv samozrejme „zmrzačia“ (to znamená, že vyrábajú modelové zvieratá na štúdium chorôb) a potom liečia. Ale to všetko prichádza iba na vedomú kliniku a spravidla to trvá 5 až 15 rokov. A ako som pochopil, keďže ide o úplne nový prístup, prvé klinické štúdie budú trvať veľmi dlho. To znamená, že budeme musieť počkať 15 až 20 rokov. Potom to bude vyzerať takto: príďte, dajte sa okamžite diagnostikovať a liečiť.
Dmitrij Madera. Foto: Science Bar Hopping
- To znamená, že nejde o úpravu genómu embryí, ale o liečbu dospelých?
— Oba prístupy budú možné.
- Poďme sa porozprávaťgénová editáciabez dvojitého rozbitia. Prečo to vedci nedokázali skôr?
"Ide o to, že to vôbec nie je ľahké."Keď som prvýkrát čítal publikáciu Nature, pomyslel som si: „Ach, ako to, že som na to nemyslel? Vtipy bokom, bolo to veľa práce, pretože pôvodne existoval podobný nápad, ale keď to vedci vyskúšali, neuspeli. Potom začali meniť reverznú transkriptázu, v podstate ju zmutovali, aby fungovala inak. A už pri určitej iterácii to začalo fungovať a začalo niečo také vyrábať. Bol to proces, ktorý si vyžadoval veľa času a financií. Preto sa nečudujem, že od vynálezu jednoducho CRISPR/Cas až po príchod metódy využívajúcej reverznú transkriptázu prešiel čas. Pretože je to netriviálne.
- Aké príležitosti sa vďaka tejto novej metóde otvárajú?
- Príležitosti sú skvelé, pretože terazUkazuje sa, že s minimálnym rizikom výskytu ofsetových mutácií môžeme veľmi špecificky zmeniť akýkoľvek gén, alelu. Napríklad, ak chceme vytvoriť bodovú mutáciu, vytvorte deléciu alebo komplexnú náhradu. To nám dáva skvelé príležitosti, pretože vo všeobecnosti je zvyčajne jedna alebo dve mutácie alebo delécie, ktoré sa vyskytnú, malé a môžu sa obnoviť v rozmedzí 40 - 50 nukleotidov.
V skutočnosti existovali technológie o niečo skôr -nukleotidové editory, ktoré jednoducho odobrali a nahradili napríklad „A“ za „G“ alebo „C“ za „T“. Takéto diela boli a stále sa používajú, ale samozrejme tam nie je všetko jednoduché, pretože sa ukázalo, že nielen editujú DNA, ale aj RNA, a nehovoria, že sú veľmi presné - presne ne Editujú jeden nukleotid a celé „okno“. Možno sa z toho následne vyvinie praktické využitie. Doteraz však existuje veľa problémov. Túto metódu som si pamätal, pretože to tiež nezahŕňa dvojvláknové prestávky. A vzniklo to o niečo skôr, ako tieto nedávne štúdie.
— Inžinieri z MIT a Harvardskej univerzitypoužitýCRISPR na vytvorenie systému dodávania liekov, ktorý ich uvoľňuje iba v konkrétnom okamihu. Ako presne sa to deje?
- Keď hovoríme konkrétne o tejto metóde, potom o nejpodstata spočíva v tom, že DNA je polymér a Cas12a ho štiepi, čím sa ničí polymérna štruktúra. Ak je DNA začlenená do hydrogélu, potom sa z nej uvoľnia látky, ktoré boli predtým fixované v hydrogéli pomocou reťazcov DNA. To znamená, že tu DNA funguje jednoducho ako fyzikálny materiál, ktorý je možné kontrolovať rozkladom. Všeobecne sa hydrogély používajú na rany a iné zranenia, keď je z nich potrebné postupne uvoľňovať liečivá.
V zásade by CRISPR/Cas mohol niečo priniesťpotrebné na pozíciu v genóme. To je všetko, čo dokáže. Ale nemôže dopraviť liek do bunky. Nie je teda úplne správne hovoriť o jeho použití na dodávanie liekov.
Ale dodať CRISPR / Cas aslieky do bunky; sú potrebné spôsoby dodania. A existujú - môžu byť vírusové a nevírusové. Vírusy sa samozrejme vyvíjali v celej svojej histórii, aby do bunky dodali určitý genetický materiál. Rozmnožujú sa tak. A nevírusové metódy sú jednoducho chemické metódy, keď sa vytvoria niektoré nosiče obsahujúce vo vnútri molekuly nukleovej kyseliny, nie nevyhnutne DNA, mimochodom to môže byť aj RNA alebo proteín. Zvyčajne to sú niektoré kvapky tuku, ktoré chránia to, čo potrebujú dodať pred nukleázami a proteázami, a môžu sa na ne zavesiť protilátky, aby im dali špecifickosť pre konkrétnu bunku. A tieto lipofilné komplexy dodávajú lieky do bunky. A existujú diela týkajúce sa zložitých polymérov alebo nanočastíc zlata, ktoré do nich ako kanón priťahujú bunky a dodávajú ich obsah, ako je napríklad genomický kanón.
- Je možné podstatne predĺžiť život človeka vďaka editácii génov? Koľko sa to dá urobiť a aké choroby je potrebné týmto spôsobom liečiť?
— Je to ťažká otázka.Faktom je, že existujú mutácie, ktoré u zvierat spôsobujú určité predĺženie života, spomalenie starnutia. Zvyčajne sú spojené so systémom opravy DNA. V mnohých ohľadoch je starnutie dôsledkom hromadenia náhodných chýb, ktoré vedú k aktivácii retrovírusových prvkov a v dôsledku toho nie je genóm regulovaný a začína pôsobiť proti svojmu hostiteľovi. Je tu jeden bod, nevieme, ako to bude fungovať u ľudí. Bohužiaľ, a to bolo veľkým prekvapením, mechanizmy starnutia a ochrany pred ním sú druhovo veľmi špecifické. A pre ľudí sa tie isté myši ukážu ako nie úplne adekvátny model. A čím je model adekvátnejší a čím dlhšie žije, tým ťažšie je s ním pracovať. Napríklad rovnaký SIRT6 - u dlhovekých druhov je to jeden a u krátkovekých je to iné, existuje jasná korelácia. Zdalo sa, že vezmite a vložte SIRT6 zo slona do človeka. Alebo niekoľko kópií ľudského SIRT6 (gén kódujúci proteín sirtuín-6 pomáha opraviť poškodenie DNA - dvojvláknové zlomy a substitúcie v písmenách genetických nukleotidov - Hi-Tech). Môže to fungovať, ale aj nemusí. Je tu taká možnosť a samozrejme by som to skúsil. Ale ak hovoríme o predĺžení života, potom s najväčšou pravdepodobnosťou musíme upraviť gény spojené s opravou DNA. Dnes je to však pre taký organizmus, akým je človek, iba hypotéza.