Aplikácia genetického inžinierstva vo vedeckom výskume
- Génový knokaut
Študovať funkciu jedného alebo druhého
Pre knockout sa rovnaký gén alebo jeho fragment syntetizuje, modifikuje tak, že génový produkt stratí svoju funkciu. Hlavné spôsoby realizácie: zinkový prst, morfolino a TALEN.
Na získanie knockoutovaných myší sa získaliGeneticky upravený konštrukt je zavedený do embryonálnych kmeňových buniek, kde konštrukt prechádza somatickou rekombináciou a nahrádza normálny gén, a zmenené bunky sú implantované do blastocysty náhradnej matky. U ovocnej mušky sa u veľkej populácie iniciujú mutácie Drosophila, u ktorých sa potom hľadajú potomstvo s požadovanou mutáciou. Rastliny a mikroorganizmy sú vyradené podobným spôsobom.
- Umelý prejav
Logickým doplnkom knockoutu jeumelý prejav, teda pridanie génu do tela, ktorý predtým nemal. Túto techniku genetického inžinierstva možno použiť aj na štúdium funkcie génov. Proces zavedenia ďalších génov je v zásade rovnaký ako v prípade knockoutu, ale existujúce gény nie sú nahradené alebo poškodené.
- Vizualizácia génového produktu
Používa sa, keď je úlohou študovaťlokalizácia génového produktu. Jednou z metód označovania je nahradenie normálneho génu génom fúzovaným s reportérovým prvkom, napríklad so zeleným fluorescenčným proteínovým génom GFP. Tento proteín, ktorý fluoreskuje v modrom svetle, sa používa na vizualizáciu produktu genetickej modifikácie.
Aj keď je táto technika pohodlná a užitočná, má vedľajšie účinkydôsledkom môže byť čiastočná alebo úplná strata funkcie študovaného proteínu. Sofistikovanejšou, aj keď nie tak pohodlnou metódou, je pridať k študovanému proteínu nie také veľké oligopeptidy, ktoré je možné detegovať pomocou špecifických protilátok.
- Vyšetrovanie mechanizmu expresie
V takýchto experimentoch je úlohou študovaťpodmienky génovej expresie. Znaky expresie závisia primárne od malého kúska DNA umiestnenej pred kódujúcou oblasťou, nazývaného promótor, ktorý slúži na viazanie transkripčných faktorov.
Toto miesto sa zavádza do tela umiestnením ponamiesto vlastného reportérového génu napríklad GFP alebo enzým, ktorý katalyzuje ľahko detegovateľnú reakciu. Okrem skutočnosti, že funkcia promótora v určitých tkanivách v tom či onom čase je zreteľne viditeľná, umožňujú také experimenty skúmať štruktúru promótora odstránením alebo pridaním fragmentov DNA a tiež umelým zlepšením jeho funkcií. .
Prečo je potrebné ľudské genetické inžinierstvo?
Pri aplikácii na človeka to dokázalo genetické inžinierstvopoužívané na liečbu dedičných chorôb. Technicky však existuje podstatný rozdiel medzi liečením samotného pacienta a úpravou genómu jeho potomka.
Úloha zmeniť dospelý genómje o niečo komplikovanejšie ako šľachtenie nových geneticky upravených plemien zvierat, keďže v tomto prípade je potrebné zmeniť genóm mnohých buniek už vytvoreného organizmu, a nie iba jedného embryonálneho vajíčka. Na tento účel sa navrhuje použiť ako vektor vírusové častice.
Vírusové častice sú schopné preniknúť dovýznamné percento dospelých buniek, ktoré do nich vkladajú svoje dedičné informácie; je možná riadená reprodukcia vírusových častíc v tele. V záujme zníženia vedľajších účinkov sa vedci zároveň snažia vyhnúť zavedeniu geneticky upravenej DNA do buniek pohlavných orgánov, čím sa zabráni dopadu na budúcich potomkov pacienta.
Za zmienku stojí aj výrazná kritika tejto technológie v médiách: vývoj geneticky modifikovaných vírusov je mnohými vnímaný ako hrozba pre celé ľudstvo.
Pomocou génovej terapie je možné v budúcnosti zmeniť ľudský genóm. V súčasnosti sú účinné metódy modifikácie ľudského genómu v štádiu vývoja a testovania na primátoch.
Dlhoročné genetické inžinierstvo opícčelili vážnym ťažkostiam, ale v roku 2009 boli experimenty korunované úspechom: v časopise Nature sa objavila publikácia o úspešnom použití geneticky upravených vírusových vektorov na vyliečenie dospelého opičieho samca z farbosleposti. V tom istom roku bol vydaný prvý geneticky modifikovaný primát (vypestovaná z upraveného vajíčka) porodila potomstvo. - kosmáč obyčajný (Callithrix jacchus).
Hoci v malom meradle, genetické inžinierstvo už ánosa zvykne dať ženám s určitými typmi neplodnosti šancu otehotnieť. Slúžia na to vajíčka od zdravej ženy. V dôsledku toho dieťa zdedí genotyp od jedného otca a dvoch matiek.
Možnosť zavedenia však významnejšiazmeny v ľudskom genóme čelia mnohým závažným etickým problémom. V roku 2016 získala skupina vedcov v Spojených štátoch amerických povolenie na klinické skúšky metódy liečby rakoviny s použitím vlastných imunitných buniek pacienta, ktoré sú geneticky modifikované pomocou technológie CRISPR / Cas9.
Koncom roka 2018 sa v Číne narodili dve deti,ktorých genóm bol umelo zmenený (gén CCR5 bol vypnutý) v embryonálnom štádiu pomocou metódy CRISPR/Cas9, v rámci výskumu realizovaného od roku 2016 v boji proti HIV. Jeden z rodičov (otec) bol infikovaný vírusom HIV a deti sa podľa vyhlásenia narodili zdravé.
Keďže experiment bol nepovolený (predtýmPreto boli všetky takéto experimenty na ľudských embryách povolené len v raných štádiách vývoja s následnou deštrukciou experimentálneho materiálu, teda bez implantácie embrya do maternice a pôrodu detí), za to zodpovedný vedec. neposkytol dôkazy pre svoje vyhlásenia, ktoré odzneli na medzinárodnej konferencii o úprave genómu.
Koncom januára 2019 čínske úrady oficiálne potvrdili fakty tohto experimentu. Vedcovi medzitým zakázali vedecké činnosti a bol zatknutý.
Ako sa upravuje ľudský genóm?
- Metóda zinkových prstov
V zložení sa nachádzajú aj „zinkové prsty“ľudské proteíny. Vďaka tejto metóde je možné navrhnúť reťazec ZFN tak, aby rozpoznával konkrétnu časť DNA. To umožňuje zamerať sa na konkrétne oblasti v rámci komplexných genómov.
Domény zinkových prstov sa nachádzajú vľudské transkripčné faktory - proteíny, ktoré regulujú proces syntézy RNA s templátom DNA. Pri vytváraní umelých nukleáz je možné zostrojiť reťazec „zinkových prstov“ tak, aby rozpoznal špecifický úsek DNA.
Ak je taká reťaz dosť dlhá, takmôže rozpoznávať relatívne rozšírené sekvencie DNA pozostávajúce z množstva trinukleotidových fragmentov. To znamená skutočnú možnosť cieleného vplyvu na konkrétne oblasti v rámci veľkých komplexných genómov.
Odhalila však aj metóda „zinkového prsta“.vážne nevýhody: po prvé, toto nie je veľmi prísne rozpoznávanie trinukleotidových opakovaní, čo vedie k značnému počtu štiepení DNA v „necieľových“ oblastiach.
Po druhé, metóda sa ukázala ako veľmi namáhavá adrahé, pretože pre každú sekvenciu DNA je potrebné vytvoriť jej vlastnú optimalizovanú štruktúru proteínov nukleáz so zinkovým prstom. Preto nie je systém „zinkových prstov“ rozšírený.
- TALEN
V roku 2011 systém pomenoval časopis Nature Methods„Metóda roka“ TALEN (transkripčné aktivátory podobné efektorové nukleázy) vďaka širokej škále možných aplikácií v rôznych oblastiach základnej a aplikovanej vedy.
TALEN je jednou z metód cielenej aplikáciezlom v DNA s jej následným „vyliečením“ - na vypnutie génov u myší. Hneď po nich sa táto technológia použila na zavedenie mutácie do myšieho genómu, ktorá viedla k rozvoju jedného z dedičných syndrómov. Autorom metódy modelovania geneticky podmienených chorôb sa podarilo myšací genóm nielen „nepokaziť“, ale aj spätne korigovať.
- CRISPR / Cas9
Metóda poskytuje presný účinok na určené oblasti DNA a je možné ju použiť v takmer akomkoľvek modernom molekulárno-biologickom laboratóriu.
Tento systém je založený na špeciálnych oblastiachbakteriálna DNA - CRISPR (klastrované pravidelne rozložené krátke palindromické opakovania alebo krátke palindromické klastrové opakovania). Tieto opakovania sú oddelené medzerníkmi - krátkymi fragmentmi cudzej DNA. Posledne uvedené sú začlenené do genómu po tom, čo sa DNA rekombinuje s jeho genómom.
Príklady humánnych úprav
- Úprava genómu priamo v tele
Choroba 44-ročného obyvateľa Arizony BrianaMado sa prejavil v ranom detstve. Je nevyliečiteľná a dedia ju hlavne muži. Mukopolysacharidóza typu II je metabolická porucha: ľudia s ňou majú mutáciu v géne zodpovednom za produkciu enzýmu, ktorý sa podieľa na štiepení komplexných sacharidov. Vďaka tomu sa hromadia v bunkách a spôsobujú početné orgánové patológie.
Muž sa rozhodol zúčastniť klinickejtestovanie novej metódy – génovej terapie. Toto je len prvá fáza štúdie a pred registráciou terapie (teda pred povolením používať túto metódu pre všetkých pacientov s Hunterovým syndrómom) musia byť traja.
Metóda použitá v Brianovom prípadeMado umožňuje upravovať genóm priamo v ľudskom tele – a zároveň presne zacieliť na konkrétny úsek DNA. Úpravy sa vykonávajú pomocou takzvaných „zinkových prstov“.
- Geneticky modifikované deti
Čínsky výskumník He Jiankui upravil genómy ľudských embryí pred oplodnením in vitro, výsledkom čoho boli dve deti so zmenenou DNA.
Výskumník systému CRISPR / Cas9upravil počas reprodukčnej liečby genómy siedmich párov embryí. V dôsledku jedného z tehotenstiev sa dve zdravé dvojčatá so zmenenou DNA narodili zo zdravej matky a otca infikovaného HIV. Jiankui vysvetlil, že odstránil gén CCR5 z detí, čo im poskytlo celoživotnú imunitu proti HIV.
- Spätné videnie pomocou génovej terapie
Na obnovenie videnia je možné použiť optogenetické technológie, pomocou ktorých je možné riadiť prácu neurónov pomocou svetlocitlivých proteínov baktérií a laserových zábleskov.
Na základe tejto myšlienky vytvorili biológovia vírus,ktoré môžu preniknúť do gangliových neurónov. Tieto nervové bunky sú zodpovedné za prenos signálov zo sietnice do ľudského mozgu. Akonáhle sa dostane do gangliovej neurózy, vírus spôsobí, že produkuje podobné signálne molekuly. Tento postup však sám o sebe neobnovuje videnie, pretože bielkoviny baktérií reagujú na svetlo odlišne od tyčiniek a čapíkov sietnice.
Na vyriešenie tohto problému bazilejský profesorUniverzita Botond Rosca University a profesor univerzity v Pittsburghu José Sahel vytvorili špeciálne okuliare, ktoré transformujú prichádzajúci obraz do formátu zrozumiteľného mozgu a stimulujú gangliové bunky pomocou laserových bleskov. Vďaka tomu môže pacient vidieť siluety veľkých predmetov a predmetov a vykonávať ďalšie zložité akcie.
Čítaj viac:
Vedci testovali teóriu panspermie na tardigradoch: môžu cestovať vo vesmíre
Vedci zistili, že super obohatené zlato sa formuje ako jogurt
Drobný vodíkový motor nahrádza náprotivky fosílnych palív