Дмитро Мадера, завідувач кафедри молекулярної генетики BIOCAD, старший викладач SPCFU, к.т.н.
У 2002 році закінчив біологічний факультет МГУза фахом генетика. Захистив дисертацію на ступінь Doctor of Phylosophy in Biology за програмою дослідження функції та експресії генів в Массачусеттского університеті, після чого працював в National Institutes of Health, вивчаючи молекулярні аспекти розвитку ракових захворювань і способи впливу на них. У 2015 році очолив лабораторію молекулярної генетики в компанії BIOCAD, з тих пір займається розробкою продуктів генної терапії. Автор міжнародного патенту, що описує нову нуклеазу сімейства Cas9 і статей в області розвитку онкологічних захворювань.
Експеримент Хе Цзянькуя, ризик онкології у народжених дівчаток і офтаргетние мутації
Що ви думаєте про експеримент китайського біофізика Хе Цзянькуя, який відредагував геном двох ембріонів?Експертистверджують, Що у народжених дівчаток могли виникнути мутації. Як уникнути подібного?— Вивчивши першоджерело (дослідження MIT — Hi-Tech) і коментар генетика Федора Урнова, я зрозумів, що ЗМІ трохи спотвореніТак, у дівчаток частіше трапляються мутації.Маються на увазі ті мутації, які невідомо, де саме вони виникнуть.І зараз важко встановити, де саме виникли випадкові мутації, що виникли в результаті CRISPR/Cas9.Для цього потрібно провести порівняння з батьками дівчаток.
Формально це правильне твердження: мутацій дійсно можуть бути, і з цим нічого не поробиш.І нинішні методи редагування генів цьому не перешкоджають.бути небезпечними.
В кінці 2018 року китайський вчений Хе Цзянькуйоголосив про те, що зумів створити генетично модифікованих дівчаток-близнят з вродженим імунітетом до ВІЛ. Він розповів, що редагував ембріони пар, що проходять процедуру ЕКО, і одна з семи спроб виявилася успішною. Експеримент викликав нову хвилю дискусій про етичність втручання в генетичний код людини.
Однак Федір Урнов, фахівець з редагуваннягенома в Каліфорнійському університеті, в інтерв'ю журналу MIT Technology Review зазначив: «твердження про те, що він відтворив превалюючий варіант CCR5, є кричущим спотворенням фактичних даних», і додав, що це можна описати тільки як «умисне введення в оману».
Нове дослідження від MIT показало, що вчені незмогли відтворити превалюючий варіант CCR5. Хоча команда була націлена на потрібний ген, дослідники не копіювали необхідну варіацію Delta 32, а замість цього створювали нові редакції, ефект яких не ясний - при цьому вони можуть викликати мутації.
Стверджують, що Хе Цзянькуй не зміг мутувати ген CCR5 (ген, який дозволяєВін дійсно досяг своєї мети, а CCR5 дійсно мутував і більше не працює, а це означає, що ВІЛ не може інфікувати клітини людини.Так, йому, мабуть, не вдалося відтворити специфічний природний алель, виявлений в людських популяціях, але тим не менш, CCR5 «нокаутований» і не працює, а це означає, що Цзянькуй досяг мінімальної мети.
Щоб запобігти офтаргетние мутації,необхідно покращувати методи редагування генома, підвищувати їх точність. Таким чином в майбутньому вийде знизити ризик виникнення мутацій до бекграундного рівня, а далі заспокоїтися на тому, що мутації відбуваються і природним шляхом. Як то кажуть, не треба бути святішим за Папу Римського.
- Тобто, коли ці дівчатка виростуть, зрозуміти, які саме мутації у них виникли внаслідок дій Цзянькуя, буде нереально?
- Якщо говорити конкретно про CCR5, то, звичайно,можна, можливо. А по всьому геному - в принципі, можна і зараз, якщо взяти генетичний матеріал їхні тата й мами і порівняти з їх власним. Тоді стане ясно, які варіанти є у батьків, а будь з тих, що присутні в геномі дівчаток, немає ні у мами, ні у тата. Інша справа, що буде неможливо дізнатися, які з мутацій виникли внаслідок CRISPR / Cas, а які випадковим чином. Можна буде лише порівняти частоту цих мутацій: скільки в нормі виникає мутацій при народженні дитини і скільки їх у цих дівчаток. Якщо їх буде на порядок більше, тоді все зрозуміло.
Технологія редагування геному CRISPR/Cas9 має потенціал для усунення тисяч спадкових захворювань, які раніше вважалися невиліковними.
Головна відмінність інструменту генногоредагування CRISPR / Cas9 від інших, досить довго існуючих способів - це можливість спрямованого зміни ДНК. CRISPR / Cas9 дозволяє точково впливати на послідовність ДНК і навіть міняти зламаний ген на правильний. Для цього спеціальний фермент нуклеаза вносить розрив в потрібне в геномі місце, після чого включається система репарації - внутрішні механізми клітини по відновленню геному. При цьому ДНК репаруючу в місці розриву, як правило, з випадковими помилками, що, найімовірніше, призведе до втрати або вставці декількох букв в послідовності і появи мутацій. Тому вона шукає в якості зразка потрібну послідовність в сусідніх геномах. Відповідно до технології, клітина повинна знайти цю послідовність в спеціальних фрагментах ДНК. Їх генетики впровадили в клітку для того, щоб взяти її і самостійно впровадити в саму себе. Однак випадкові мутації в місці розриву виникають набагато частіше, ніж спрямована репарація за зразком.
Інше питання, Костянтин Северинов (російський фахівець в області молекулярної біології і CRISPR/Cas – Hitech) якось висловив цікаву думку про те, що якби там було щось зовсім жахливе, то дівчата просто не вижили б на етапі ембріогенезу.Швидше за все, нічого принципового в їхньому геномі не було порушено.Єдине, що мене лякає – це онкологія.схожі захворювання.
- Чому? Виникнення онкології більш вірогідним стає в результаті редагування генома людини?
Давайте розглянемо причини виникнення раку.Їх три: спадкові мутації, тобто особливі алелі, які несуть в собіймовірність підвищеного ризику онкологічних захворювань, наприклад, у Анджеліни Джолі; вірусні причини – вірус папіломи людини, наприклад; і випадкові мутації.Саме виникнення мутацій останнього типу у дівчат в китайському експерименті я побоююся, особливо якщо була висока частота мутацій.При цьому ймовірність виникнення будь-якого виду пухлини відрізняється від нуля.
Дмитро Мадера. Фото: Science Bar Hopping
Як редагувати геном людини, країни-лідери та доля російської генетики
- Наскільки простіше проводити подібні експерименти з тваринами?
— Для редагування геному кожної тваринипотрібний свій власний протокол. Редагувати мишу чи корову потрібно з різними протоколами. І людина, як ще одна тварина, вимагає її розвитку для себе, щоб редагувати її геном найбільш ефективно. Тому не можна сказати, що людину редагувати складніше, ніж корову. Просто потрібно це робити інакше, ніж у випадку з мишею чи щуром. Але підходи залишаються такими самими. Нічого дуже відмінного у нас немає.
- Тобтопроблема лежить лише в області етики і законів? І якби її вирішили, то експериментів було б більше?
- Безперечно.А потім експериментів досить багато насправді. Я їжджу на конференції та часто зустрічаю колег. Наприклад, в Орегонському університеті проводять чудові експерименти з редагування геному людини та вирощування ембріонів. Просто їх згодом знищують на певному ранньому етапі. Подібні експерименти не заборонені. По суті, єдине обмеження – підсаджування ембріона та його вирощування аж до народження.
- Які країни сьогодні в лідерах досліджень по редагуванню генома людини?
— Таких лідерів зараз два, між ними та всімаіншими абсолютна прірва. Це США та Китай. Далі навіть близько ніхто не стоїть, настільки вони відірвалися у своїх дослідженнях від решти світу.
- Це пов'язано з фінансуванням або науковою базою?
— І з тим, і з іншим.Китай вкладає у дослідження дуже великі гроші, їхня влада це дуже турбує. І якщо раніше вони займалися простим копіюванням технології, зараз китайські вчені роблять цікаві речі. А у США просто дуже сильна наукова база. Власне, де були відкриті всі ці CRISPR/Cas — більшість першовідкривачів цього методу, окрім Дженніфер Дудни, китайці, але вони працюють у США. Тож вийшла така синергія двох країн.
— А що заважає Росії розвиватися у цій галузі? Навіть президентзаявивпро пріоритет досліджень у напрямі генетики.
- Скажу так, сьогодні вже є фінансуваннядосліджень - багато виділяється грошей. Але, звичайно, це все в одну годину не робиться. Потрібні наукова база і школа. У Росії в плані генетики все сумно після лисенківщини. До Лисенко радянська школа генетики була однією з кращих в світі. Вавилов їздив до Моргану (Томас Морган - один з основоположників генетики, лауреат Нобелівської премії - «Хайтек»), і вони спілкувалися на рівних. Після Лисенко все було знищено варварським способом. І з тих пір ми не можемо відновитися. Так, гроші - це дуже важливо. Але також необхідно, щоб хлопці йшли вчитися, щоб залучалися іноземні фахівці. А буде школа - буде і геномної редагування в Росії.
- Як на це вплинуть недавні рекомендації щодо комунікації між російськими і закордонними вченими - повідомляти про всі контакти, практично доносити, як в Радянському Союзі?
- Це дуже страшно. Найгірше, що можна зробити для російської науки і вбити її остаточно, - ці рекомендації. Причому я розумію, що це всього лише рекомендації, і їх необов'язково виконувати. Але люди ж, самі розумієте, бояться. І починають їх виконувати превентивно. Особливо не вчений, а бюрократи від науки. Вони почнуть припиняти спілкування з іноземними вченими. Я знаю історію, коли чоловік і жінка-вчені з Німеччини в вряди-годи приїхали на якусь конференцію в Росію, а зарубіжні вчені не часто їздять до нас, і їх не пустили на територію заходу через цих приписів. Наука інтернаціональна, і потрібно якомога більше спілкуватися і взаємодіяти з колегами, і тоді буде толк. Я різко засуджую ці приписи.
Лікування глухоти, небезпечні захворювання і доставка ліків
- Російський генетик Денис Ребриковзбираєтьсявідредагувати геном ембріонів для пар із відхиленнями слуху. Наскільки ймовірним є успіх подібного експерименту?
— Денис Володимирович врахував усі помилки свогокитайського колеги. Він має намір провести повне геномне секвенування. І сам експеримент проходитиме у більш контрольованій обстановці, не в напівпідпільних умовах, як це було у Цзянькуя. Я думаю, що успіх у принципі, з методологічної точки зору, можливий, і виявиться, що все не таке страшне, особливо при використанні сучасних методів. А рівень мутування може бути на рівні бекграунду. А щодо цих хворих дітей, то так, це моногенна мутація, причому вона домінантна, тобто її досить просто знищити, що генетики вже добре роблять. І, власне, все, далі ніщо не стоїть на заваді.
— Як це поєднується із російським законодавством?
- Що стосується законодавчих аспектів, Ребриковнад цим якраз і працює. І в цьому сенсі дуже цікаво дізнатися, що там вийде. Мені б дуже хотілося, щоб у нього вийшло пробити цю законодавчу стіну. Хоча його приклад і те захворювання, яке він вибрав, на погляд багатьох моїх колег і мій теж, не так вже й актуальні. Але поле-то відкривається величезне, тому нехай він буде першим і покаже хороший результат. І далі можна буде розширювати «репертуар».
- Які ще небезпечні захворювання можна лікувати за допомогою CRISPR / Cas?
— Звичайно, муковісцидоз — дуже важкий.захворювання. Можна використовувати генне редагування в лікуванні міодистрофії Дюшенна, хоча б у деяких пацієнтів, у яких більш-менш потрібна для цього мутація. Взагалі моногенних генетичних хвороб понад 10 тис. І тут питання, який метод більш зручний і простий для лікування. Наприклад, спинальну м'язову атрофію потрібно лікувати не редагуванням, а просто замісною генною терапією.
муковісцидоз- системне спадкове захворювання,обумовлене мутацією гена трансмембранного регулятора муковісцидозу, що характеризується ураженням залоз зовнішньої секреції, тяжкими порушеннями функцій органів дихання. Муковісцидоз представляє особливий інтерес не лише через широку поширеність, а й тому, що це одне з перших спадкових захворювань, яке намагалися лікувати. Вперше муковісцидоз було визнано окремою нозологією Дороті Андерсен у 1938 році.
миодистрофия Дюшенна- Викликається делеціями або дуплікаціями одногоабо кількох екзонів або точковими мутаціями у гені дистрофіну. Основний прояв - слабкість м'язів, утруднення при рухах з дитячого віку, які прогресують із часом. Смерть зазвичай настає другого-третьому десятилітті життя. Середня її тривалість становить 25 років, проте є люди, які довше живуть.
- Коли вченим вдасться це зробити? Назвіть хоча б тимчасової діапазон?
— Дивіться, зараз тварин уже лікують.Щоправда, спочатку «калічать», звичайно (тобто роблять модельних тварин для вивчення захворювань), а потім лікують. Але все це тільки виходить на усвідомлену клініку, а вона зазвичай триває від 5 до 15 років. І я так розумію, оскільки це абсолютно новий підхід, то перші клінічні дослідження триватимуть дуже довго. Отже, років 15–20 доведеться почекати. Тоді це буде виглядати вже в такий спосіб — приходьте, діагностуйте і відразу ж лікують.
Дмитро Мадера. Фото: Science Bar Hopping
- Тобто вже мова не про редагування генома ембріонів, а про лікування дорослих людей?
— Обидва підходи будуть можливі.
- Поговоримо прогенному редагуваннібез подвійного розриву. Чому раніше вчені не могли його зробити?
— Справа в тому, що це зовсім нелегко.Коли я спочатку прочитав публікацію в Nature, то подумав: «Ех, як я до цього не додумався». Окрім жартів, це була велика робота, бо спочатку подібна ідея була присутня, але коли вчені її випробували, у них нічого не вийшло. Потім вони почали змінювати обернену транскриптазу, фактично її мутувати, щоб вона працювала по-іншому. І вже на певній ітерації вона запрацювала і почала щось таке продукувати. Це був процес, який вимагав багато часу та фінансування. Тому я не здивований, що з моменту винаходу просто CRISPR/Cas і до моменту появи методу з використанням зворотної транскриптази минув час. Тому що це нетривіально.
- Які можливості відкриваються завдяки цьому новому методу?
- Можливості великі, тому що тепервиходить, що ми можемо з мінімальними ризиками виникнення офтаргетних мутацій дуже специфічно міняти будь-який ген, алель. Наприклад, якщо ми хочемо встановити яку-небудь точкову мутацію, створити делецию або складну заміну. Це дає нам великі можливості, тому що, за великим рахунком, зазвичай одна-дві мутації або делеція, які виникають, невеликого розміру, і їх можна відновити в межах 40-50 нуклеотидів.
Насправді трохи раніше були технології -нуклеотидні редактори, які просто брали і замінювали, наприклад, «А» на «Г» або «Ц» на «Т». Такі були роботи і вони до сих пір застосовуються, але там, звичайно, все не просто, тому що виявляється, що вони редагують не тільки ДНК, але і РНК теж, і точність у них не сказати, що дуже велика - вони редагують неточно один нуклеотид, а ціле «вікно». Може бути, це теж згодом розвинеться до практичного використання. Але поки там багато проблем. Я згадав про цей метод, тому що він теж не передбачає дволанцюжкових розривів. І він виник трохи раніше, ніж ці останні дослідження.
— Інженери з Массачусетського технологічного та Гарвардського університетіввикористовувалиCRISPR для створення системи доставки ліків, яка вивільняє їх лише у певний момент. Як саме це відбувається?
- Якщо говорити конкретно про цей спосіб, то йогосуть зводиться до того, що ДНК - це полімер, а Cas12a його розрізає, тим самим руйнуючи полімерну структуру. Якщо ДНК при цьому інкорпорована в гідрогель, то з нього після цього починають вивільнятися речовини, які до того були закріплені в гідрогелі нитками ДНК. Тобто тут ДНК виступає просто як фізичний матеріал, який можна контрольовано розкладати. А взагалі гідрогелю використовуються на ранах і інших пошкодженнях, коли необхідно поступове вивільнення ліків з них.
В принципі, CRISPR/Cas може доставляти щосьнеобхідне позиції в геномі. Це все, що він може робити. А доставити ліки до клітини — не може. Тож не зовсім коректно говорити про його використання для доставки ліків.
Але щоб доставити CRISPR / Cas якліки в клітку, необхідні методи доставки. І вони існують - можуть бути вірусними і невірусні. Віруси, ясна річ, еволюціонували протягом всієї своєї історії, щоб доставляти якийсь генетичний матеріал в клітину. Вони так розмножуються. А невірусні методи - просто хімічні способи, коли створюються якісь носії, що містять в собі молекули нуклеїнової кислоти, не обов'язково ДНК, до речі, це може бути навіть РНК або білок. Зазвичай вони з себе представляють якісь крапельки жиру, які екранують то, що вони повинні доставити від нуклеаз і протеаз, також на них можна навішувати антитіла, щоб надавати їм специфічність для конкретної клітини. І ці ліпофільні комплекси доставляють ліки в клітку. А є роботи, пов'язані зі складними полімерами або золотими наночастинками, якими як з гармати стріляють по клітинам, вони влітають в них і доставляють свій вміст, отака геномна гармата.
- Чи можливо суттєво продовжити життя людині завдяки генному редагування? Наскільки це можна зробити і які хвороби потрібно вилікувати таким чином?
- Важке питання.Справа в тому, що є мутації, які на тваринах викликають якесь продовження життя, уповільнення старіння. Зазвичай вони пов'язані із системою репарації ДНК. Багато в чому старіння - це наслідок накопичення випадкових помилок, які призводять до активації ретровірусних елементів, і в результаті геном не регулюється і починає працювати проти свого господаря. Тут такий момент ми не знаємо, як це буде працювати на людях. На жаль, і це стало великим сюрпризом, механізми старіння та захисту від нього дуже видоспецифічні. І для людини ті ж миші виявляються не зовсім адекватною моделлю. А чим адекватніша модель і чим довше вона живе, тим складніше з нею працювати. Наприклад, той же SIRT6 - у довгоживучих видів він один, а короткоживучих видів - інший, є чітка кореляція. Здавалося, візьми та встав SIRT6 від слона до людини. Або кілька копій людського SIRT6 (ген, що кодує білок сиртуїн-6, допомагає виправляти ушкодження в ДНК — подвійні розриви в ланцюгах та заміни в генетичних літерах-нуклеотидах — «Хайтек»). Це може спрацювати, а може й ні. Імовірність така є, і я, звичайно, спробував би. Але якщо й говорити про продовження життя, то, найімовірніше, необхідно редагувати гени, пов'язані з репарацією ДНК. Сьогодні, втім, для такого організму як людина це лише гіпотеза.