Застосування генної інженерії в наукових дослідженнях
- нокаут гена
Для вивчення функції того чи іншого
Для нокауту синтезують такий самий ген або його фрагмент, змінений так, щоб продукт гена втратив свою функцію. Основні методи реалізації: цинковий палець, морфоліно та TALEN.
Для отримання нокаутних мишей отриманугенно-інженерну конструкцію вводять в ембріональні стовбурові клітини, де конструкція піддається соматичної рекомбінації і заміщає нормальний ген, а змінені клітини імплантують в бластоцисту сурогатної матері. У плодової мушки дрозофіли мутації ініціюють у великій популяції, в якій потім шукають потомство з потрібною мутацією. Подібним способом отримують нокаут у рослин і мікроорганізмів.
- штучна експресія
Логічним доповненням нокауту єштучна експресія, тобто додавання в організм гена, якого у нього раніше не було. Цей спосіб генної інженерії також можна використовувати для дослідження функції генів. По суті процес введення додаткових генів такий же, як і при нокауті, але існуючі гени не заміняють і не пошкоджуються.
- Візуалізація продуктів генів
Використовується, коли завданням є вивченнялокалізації продукту гена. Одним із способів мічення є заміщення нормального гена на злитий з репортерним елементом, наприклад, геном зеленого флуоресцентного білка GFP. Цей білок, що флуорескує у блакитному світлі, використовується для візуалізації продукту генної модифікації.
Хоча така техніка зручна і корисна, її побічниминаслідками може бути часткова або повна втрата функції досліджуваного білка. Більш витонченим, хоча і не настільки зручним методом є додавання до досліджуваного білку не настільки великих олігопептидів, які можуть бути виявлені за допомогою специфічних антитіл.
- Дослідження механізму експресії
У таких експериментах завданням є вивченняумов експресії гена Особливості експресії залежать передусім від невеликої ділянки ДНК, розташованої перед областю, що кодує, який називається промотор і служить для зв'язування факторів транскрипції.
Ця ділянка вводять в організм, поставивши післянього замість власного гена репортерний, наприклад, GFP або ферменту, що каталізує легко виявляємо реакцію. Крім того, що функціонування промотора в тих чи інших тканинах в той чи інший момент стає добре помітним, такі експерименти дозволяють досліджувати структуру промотора, прибираючи або додаючи до нього фрагменти ДНК, а також штучно посилювати його функції.
Навіщо потрібна генна інженерія людини
У застосуванні до людини генна інженерія могла бзастосовуватися для лікування спадкових хвороб. Однак, технічно, є істотна різниця між лікуванням самого пацієнта і зміною генома його нащадків.
Завдання зміни геному дорослої людинидещо складніше, ніж виведення нових генноінженерних порід тварин, оскільки в даному випадку потрібно змінити геном численних клітин організму, що вже сформувався, а не однієї лише яйцеклітини-зародка. Для цього пропонується використовувати вірусні частинки як вектор.
Вірусні частинки здатні проникати взначний відсоток клітин дорослої людини, вбудовуючи у них свою спадкову інформацію; можливе контрольоване розмноження вірусних частинок в організмі. При цьому для зменшення побічних ефектів вчені намагаються уникати застосування генноінженерних ДНК у клітини статевих органів, тим самим уникаючи впливу на майбутніх нащадків пацієнта.
Також варто відзначити значну критику цієї технології в ЗМІ: розробка генно-інженерних вірусів сприймається багатьма як загроза для всього людства.
За допомогою генотерапії в майбутньому можлива зміна геному людини. В даний час ефективні методи зміни геному людини знаходяться на стадії розробки та випробувань на приматах.
Довгий час генетична інженерія мавпстикалася з серйозними труднощами, проте в 2009 році експерименти увінчалися успіхом: в журналі Nature з'явилася публікація про успішне застосування генноінженерних вірусних векторів для лікування дорослого самця мавпи від дальтонізму. - Звичайна ігрунка (Callithrix jacchus).
Хоча й у невеликому масштабі, генна інженерія вжевикористовується для того, щоб дати шанс завагітніти жінкам з деякими різновидами безпліддя. Для цього використовують яйцеклітини здорової жінки. Дитина в результаті успадковує генотип від одного батька та двох матерів.
Однак можливість внесення значнішихзмін в геном людини стикається з низкою серйозних етичних проблем. З 2016 в США група вчених отримала схвалення на клінічні випробування методу лікування раку за допомогою власних імунних клітин пацієнта, що піддаються генної модифікації із застосуванням технології CRISPR / Cas9.
Наприкінці 2018 року в Китаї народилося двоє дітей,геном яких було штучно змінено (вимкнено ген CCR5) на стадії ембріона методом CRISPR/Cas9, у рамках досліджень, які проводяться з 2016 року по боротьбі з ВІЛ. Один із батьків (батько) був ВІЛ-інфікованим, а діти, за заявою, народилися здоровими.
Оскільки експеримент був несанкціонованим (доцього всі подібні експерименти на людському ембріоні дозволялися лише на ранніх стадіях розвитку з подальшим знищенням експериментального матеріалу, тобто без імплантації ембріона в матку та народженням дітей), відповідальний за нього вчений не надав доказів своїм заявам, які були зроблені на міжнародній конференції з редагування .
В кінці січня 2019 року владою Китаю були офіційно підтверджені факти проведення даного експерименту. Тим часом вченому було заборонено займатися науковою діяльністю і він був заарештований.
Як редагують людський геном?
- Метод «цинкові пальці»
«Цинкові пальці» зустрічаються і в складілюдських білків. Завдяки цьому методу можна сконструювати ланцюг ZFN так, що вона буде дізнаватися певну ділянку ДНК. Це дає можливість точкового впливу на задані ділянки в складі складних геномів.
Домени «цинкові пальці» зустрічаються у складілюдських факторів транскрипції – білків, що регулюють процес синтезу РНК із матрицею ДНК. При створенні штучних нуклеаз можна сконструювати ланцюжок з «цинкових пальців» так, що він впізнаватиме певну ділянку ДНК.
Якщо такий ланцюжок буде досить довгою, вонаможе розпізнавати щодо протяжні послідовності ДНК, що складаються з ряду тринуклеотидних фрагментів. Це означає реальну можливість точкового впливу на задані ділянки в складі великих складних геномів.
Однак у методу «цинкових пальців» виявились ісерйозні недоліки: по-перше, це не суворе розпізнавання тринуклеотидних повторів, що призводить до помітної кількості розщеплень ДНК у «нецільових» ділянках.
По-друге, метод виявився вельми трудомістким ідорогим, оскільки для кожної послідовності ДНК необхідно створити свою оптимізовану білкову структуру zinc-finger нуклеази. Тому система «цинкові пальці» широкого поширення не отримала.
- TALEN
У 2011 році журнал Nature Methods назвав системуTALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) «методом року» завдяки широкому спектру можливих застосувань в різних областях фундаментальної та прикладної науки.
TALEN - один із способів спрямованого внесеннярозриву в ДНК з подальшим його «заліковуванням» - для виключення генів у мишей. Відразу після них цю технологію застосували для внесення в мишачий геном мутації, що призводить до розвитку одного з спадкових синдромів. Авторам методу моделювання генетично обумовлених хвороб вдалося не тільки «зіпсувати» мишачий геном, але і виправити його назад.
- CRISPR / Cas9
Метод забезпечує точне вплив на задані ділянки ДНК і може бути використаний практично в будь-якій сучасній молекулярно-біологічної лабораторії.
В основі цієї системи - особливі ділянкибактеріальної ДНК - CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, або короткі паліндромний кластерні повтори). Поділяють ці повтори спейсери - короткі фрагменти чужорідної ДНК. Останні вбудовуються в геном після того, як ДНК рекомбинирует з її геномом.
Приклади редагування людини
- Редагування генома прямо в тілі
Захворювання 44-річного жителя Арізони БрайанаМадо проявилося ще в ранньому дитинстві. Воно невиліковно і будуть нащадками Його в основному чоловіки. Мукополісахарідоз II типу - це метаболічне розлад: у людей з ним є мутація в гені, відповідальному за виробництво ферменту, який бере участь у розщепленні складних вуглеводів. У підсумку вони накопичуються в клітинах і викликають численні патології органів.
Чоловік вирішив взяти участь у клінічномувипробування нового методу - генної терапії. Це лише перша фаза дослідження, а всього до реєстрації терапії (тобто до дозволу застосовувати цей метод для всіх хворих із синдромом Хантера) їх має бути три.
Метод, який використовували у разі БрайанаМадо дозволяє редагувати геном прямо в тілі людини - і при цьому досить точно потрапляти в конкретну ділянку ДНК. Редагування відбувається за допомогою так званих цинкових пальців.
- Генетично модифіковані діти
Китайський дослідник Хе Цзянькуй відредагував геноми людських ембріонів перед процедурою штучного запліднення, в результаті чого на світ з'явилися двоє дітей зі зміненою ДНК.
За допомогою системи CRISPR / Cas9 дослідниквідредагував геноми ембріонів семи пар під час репродуктивного лікування. В результаті однієї з вагітностей від здорової матері і ВІЛ-інфікованого батька народилися дві дівчинки-двійнята зі зміненою ДНК. Хе Цзянькуй пояснив, що видалив у дітей ген CCR5, завдяки чому вони отримали довічний імунітет до ВІЛ.
- Повернення зору за допомогою генної терапії
Для відновлення зору можна використовувати оптогенетіческіе технології, за допомогою яких роботою нейронів можна керувати за допомогою світлочутливих білків бактерій і спалахів лазера.
Керуючись цією ідеєю, біологи створили вірус,який може проникати в гангліонарні нейрони. Ці нервові клітини відповідають за передачу сигналів з сітківки в мозок людини. Що потрапив в гангліонарний нейрос вірус змушує його виробляти подібні сигнальні молекули. Однак ця процедура не повертає зір сама по собі, так як білки бактерій реагують на світло не так, як палички і колбочки сітківки.
Щоб вирішити цю проблему, професор Базельськогоуніверситету Ботонд Роська і професор Піттсбурзького університету Хосе Сахель створили спеціальні окуляри, які перетворять надходять в них зображення в зрозумілий мозку формат і стимулюють гангліонарні клітини спалахами лазера. В результаті пацієнт може бачити силуети великих предметів і об'єктів та здійснювати інші складні дії
Читати далі:
Вчені перевірили теорію панспермії на тихоходки: вони можуть подорожувати в космосі
Вчені з'ясували, що сверхобогащения золото утворюється як кисле молоко
Крихітний водневий двигун замінив аналоги на викопному паливі