Лабораторію мас-спектрометрії "Сколтеха" очолює член-кореспондент Російської академії наук
Що лежить в основі побудови життєвих процесів
ДНК - це полімерні довгі ланцюжки, що зберігають інформацію про те, як повинен виглядати і функціонувати організм.Тобто про те, чим ми відрізняємось від інших видіві чим дві особи одного виду відрізняються один від одного. Ці молекули визначають нашу унікальність. Наведу такий приклад: гусениця і метелик, в який він переростає. Як ви вважаєте, у них молекули ДНК різні чи однакові? Насправді правильна відповідь: однакові. Генетична інформація в ході життєдіяльності не змінюється. Власне, чому гусениця та метелик у результаті різні? Тому що далеко не вся інформація, яка зберігається в ДНК, одночасно реалізується. Реалізація відбувається через процес транскрипції, у результаті після зчитування окремих генів матрична РНК дозволяє синтезувати білки.
Білки - це універсальні молекулярні машини в нашому організмі, виконують різні функції: від будівельної до регуляторної.Одне із застарілих визначень життя — цеупорядковане існування та взаємодія білкових молекул. Але проблема в тому, що білкові молекули також великі. Білки це теж полімерні молекули з великою молекулярною масою: зазвичай від 10 до декількох сотень кілодальтон. І побудувати основні життєві процеси на них досить проблематично, тому що вони досить чутливі до змін температури та довкілля. І, мабуть, тому майже всі життєво необхідні процеси у клітині реалізуються через малі молекули. А перетворенням малих молекул одна в одну вже керують білки. Молекулярна маса цих малих молекул: від кількох десятків до кількох сотень кілодальтон. Усі малі молекули, що у живому організмі, називаються метаболітами.
1 дальтон, або 1 атомна одиниця маси (а. Е. М.)- Позасистемна одиниця маси, що застосовується для мас молекул, атомів, атомних ядер та елементарних частинок.
1 а. е. м. = 1,660 539 066 60 (50) ⋅10-27 кг.
Первинні метаболіти - це хімічні речовини, які є в усіх клітинах організму і необхідні для забезпечення життєво важливих процесів.З них будуються всі полімерні молекули, білки тануклеїнові кислоти. Ці метаболіти всім клітин одного організму однакові. У ході життєдіяльності метаболіти перетворюються один на одного, наприклад з метою перенесення енергії. І такі шляхи перетворення — ланцюжка перетворення — називаються шляхами метаболізму.
Цикл Кребса, або цикл трикарбонових кислот, що відповідають за процес клітинного дихання.
Різні шляхи метаболізму в організмі людини перетинаються, тобто мають спільних учасників.Таким чином, всі процеси, які протікають з метаболітами, взаємопов'язані.
Вторинні метаболіти - це речовини, які не потрібні всім клітинам для забезпечення життєдіяльності.Зазвичай вони використовуються для адаптації до умовдовкілля. Наприклад, кавові рослини виробляють кофеїн для захисту свого листя від шкідників. Вони токсичні для жуків, які пожирають листя кавових рослин. Але якщо ми якимось чином приберемо весь кофеїн із рослини, воно продовжить жити. Жодних життєво важливих процесів порушено не буде. Другий приклад – це антибіотики. Ви знаєте, що пеніцилін - це перший антибіотик, і він був випадково виділений з цвілевих грибів, що здійснило революцію в медицині. Плісняві гриби використовують пеніцилін для того, щоб розчистити собі життєвий простір. Він нешкідливий для батьківського організму, а інших мікроорганізмів токсичний. Власне, цю властивість людина і використовує для лікування різних бактеріальних інфекцій. Через те, що людина активно споживає рослини, наш організм густо населений різними мікроорганізмами, що формують мікрофлору. Ці речовини — вторинні метаболіти не лише самої людини, а й живих організмів, які неминуче потрапляють до нашого організму.
Природний фільтр і чому він помиляється
Ксенометаболіти - це антибіотики, з'єднання, які з діяльністю живих організмів не пов'язані.Це, як правило, щось, що людина отрималаштучно із різними цілями. Наприклад, ліки, харчові добавки, БАДи, допінг, наркотики, продукти горіння тютюну, алкоголь чи засоби гігієни, побутова хімія, екотоксиканти. Це теж малі молекули, і вони потрапляють до організму як навмисно, у разі ліків, так і випадково. Наприклад, ви чистили зуби, проковтнули зубну пасту, і так до вас потрапили нові хімічні речовини. І багато з цих речовин можуть вплинути на наш організм, навіть у дуже маленьких концентраціях. Причому цей вплив може бути як позитивним, так і негативним або змінюватись в залежності від кількості цієї речовини.
Печінка є першим бар'єром на шляху проникнення чужорідних хімічних речовин в системний кровотік.Вона намагається відфільтрувати молекули, якіорганізму нашкодять і вивести їх, не пускаючи їх далі кровотоком до органів. Печінка має багато механізмів фільтрації, але жоден з них не спрацьовує на 100%: інакше не було б отруєнь і важких наслідків прийому будь-яких токсинів або наркотиків. Тим не менш, печінка користується тим фактом, що наш організм більшою мірою – це вода, тобто він відсотків на 80 складається з води. Тому печінка намагається відсортувати молекули на гідрофільні, які у воді розчиняються, та на гідрофобні. Печінка «вважає», що якщо гідрофільна речовина, то його можна далі пускати в системний кровотік, так як воно сильно нашкодити не повинно. А якщо речовина гідрофобна, то з нею потрібно щось робити, щоб не пустити її далі або як мінімум зробити її більш гідрофільною.
Печінка має два механізми — фази метаболізму.У першій фазі печінка намагається за допомогоюспеціальних білків, ферментів сімейства цитохром Р450 ці речовини окислити. Внаслідок окислення структура молекули змінюється, і вона може стати більш гідрофільною. Далі печінка може пустити ці метаболіти в кровотік або спробувати вивести їх через нирки із сечею чи через кишечник. Якщо це не спрацьовує, печінка може до цих окислених молекул пришити готові гарантовано водорозчинні молекули.
Печінковий метаболізм збільшує різноманітність малих молекул, які можуть опинитися у нашому організмі.Наприклад, на стадії окислення з однієї молекули теоретично утворюється більше ніж 500 різних нових інших молекул, передбачити, які з них утворюються, а які ні, не представляється можливим.
Нескінченний «алфавіт»: чому так важко вивчати метаболіти
Нуклеїнові кислоти можна представити у вигляді пятібуквенного алфавіту, з якого будується велика текстова рядок.Так, звичайно, послідовність букв у ційрядку може бути відносно хаотичним, хоча в ході життєдіяльності ДНК не змінюється, а просто копіюється. Тому ми маємо певні обмеження на те, яким буде цей рядок. У випадку з білками ситуація дещо складніша: літер в алфавіті буде вже 20, тобто 20 амінокислот, з яких побудовані білки, але це відбувається мимовільним чином. Тому ці об'єкти, з погляду дослідника, також досить схожі між собою. А у випадку з метаболітами виділити якийсь алфавіт вкрай проблематично: по суті, це вся таблиця Менделєєва. А з правил формування – лише правило валентності. Крім того, є особливість хімії вуглецю, яка дозволяє двом атомам вуглецю зв'язуватися між собою і потім, згодом приєднувати ще необмежену кількість атомів вуглецю або інших атомів з Менделєєвої таблиці, що породжує величезну хімічну різноманітність таких молекул.
Для вивчення таких маленьких молекул і всього їх розмаїття необхідні спеціальні методи.Є прості:наприклад, органолептичний аналіз, з яким стикався кожен, хто здавав загальний аналіз крові чи сечі і бачив, що у напрямку є рядок «запах, колір». Коли необхідно знайти конкретну молекулу розчині, туди додають краплю заздалегідь обраного реагенту. Якщо молекула в розчині була, станеться забарвлення, якщо не було – з'явиться лише осад. Серед простих методів також є оптична спектроскопія, коли можна за допомогою мікроскопа структурою осаду зробити висновки. Досить популярні зараз імунохімічні методи: це той самий тест ІФА на COVID-19.
Оміксні дослідження — це дослідження, у яких вивчається певна повна сукупність.А метаболоміка має на увазі аналіз великихданих, які представляють повний набір малих молекул в деякому організмі, клітці або органі. Набір цих даних варіюється за різними оцінками від декількох тисяч, якщо ми розглядаємо тільки первинні метаболіти, до декількох десятків тисяч, якщо ми до них приєднуємо вторинні метаболіти відомих рослин, бактерій і грибів. Насправді, до декількох сотень мільйонів, якщо враховувати всю хімічну різноманітність, яке може в організм людини потрапити. І для їх вивчення потрібні спеціальний методи: спектроскопія ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і мас-спектрометрії.
За 80-річну історію існування ЯМР вчені, які займалися цим методом, отримали п'ять Нобелівських премій.Чотири – за ЯМР, і п'яту – замагнітно-резонансну томографію Метод, що трохи відрізняється від ЯМР-спектроскопії, але дуже споріднений за принципом. Метод ЯМР полягає в тому, що деякі атоми в таблиці Менделєєва мають ненульовий магнітний момент. Вони є маленькі магнітики і можуть взаємодіяти із зовнішнім магнітним полем. Ця взаємодія проявляється у розщепленні енергетичних рівнів. ЯМР-метод дозволяє розрізняти різні атоми та атоми одного елемента, але в різному оточенні. Останнім часом ЯМР втрачає популярність насамперед через свою високу вартість.
Як зробити зі складної суміші заряджені частинки і з'ясувати їх склад
Мас-спектрометрія - це метод розділення заряджених частинок за рахунок їх взаємодії з електромагнітним полем.Якщо взяти якусь складну суміш, що складається зрізних заряджених частинок, а практично будь-яку молекулу сучасними методами мас-спектрометрії можна перевести в заряджену форму, додавши до неї або відірвавши від неї протон, і вплинути на цю суміш електромагнітним полем, то частинки в цьому полі почнуть рухатися і у них буде швидкість, чи траєкторія, що залежить від маси. Легкі частинки прилетять до детектора раніше, ніж тяжкі. Після обробки даних з детектора отримують мас-спектр, в якому по осі Y буде інтенсивність сигналів, яка пропорційна кількості іонів, а по осі X - маси в іонах, а точніше, співвідношення маси до заряду. Причому мас-спектрометрія дає змогу виміряти масу з дуже високою точністю. Отже, можна однозначно встановити елементний склад іона, заряджених частинок чи молекули, з якої він утворився. Математично це називається рішення діофантового рівняння у цілих числах: за фактом це підбір коефіцієнтів біля кожного атома: m(C), m(H), k(O), z(N). І тільки одна комбінація цілих чисел m, n, k, z може дати масу, яку поміряв мас-спектрометр.
Метод мас-спектрометрії був запропонований на початку ХХ століття Томпсоном.Вчені зібрав перший у світі мас-спектрометр і зйого допомогою зробив велике відкриття: експериментально підтвердив існування ізотопів. З іншого боку, він не зміг дати коректної інтерпретації своїм результатам. За нього це зробив його учень Вільям Астон: 1922 року він за це відкриття отримав Нобелівську премію. У ХХ столітті через низку світових війн мас-спектрометрія розвивалася як метод для військових. Основне застосування на початку свого розвитку знайшла в атомної промисловості. Оскільки мас-спектрометрія дозволяє розділяти речовини по масі та визначати ізотопи, значить її можна використовувати для поділу ізотопів, наприклад, урану. За мас-спектрометрію було видано ще дві нобелівські премії: 1989 року — Вольфганг Пауль і Ганс Демельт, а згодом 2002 року — справжню революцію здійснили незалежно одна від одної Джон Фенн та Каїші Танака. Вони запропонували свій метод, що дозволяє отримати заряджену частинку великої полімерної молекули: з білків або з нуклеїнових кислот, не зруйнувавши її. Це дало поштовх до вивчення. Нині жодна лабораторія — біохімічна чи лабораторія молекулярної біології — без власного мас-спектрометра чи без добре оснащеного центру колективного користування в інституті працювати не може.
Визначивши масу іона, ми можемо визначити тільки елементний склад, але не структуру молекул.Тому що одному елементному складу різних структур може відповідати величезна кількість. Тобто атоми в молекулі можна розташувати по-різному. Це називається явищем ізомерії.
Мас-спектрометрісти придумали спосіб, що дозволяє отримати трошки більше інформації про структуру молекули: на шляху летять прискорених молекул ставиться якусь перешкоду.Зазвичай це молекули газу.Коли молекули стикаються з цими молекулами газу, вони можуть розвалитися на частини такого зіткнення. І далі мас-спектрометр вимірює масу не вихідної молекули, а тих шматочків, куди вона розпалася. А розпад цей відбувається не випадковим чином, а по найслабших зв'язках у молекулі. В результаті виходять однакові фрагменти і є молекулярними відбитками пальців: унікальними для кожної молекули.
Хроматографія - це метод розділення речовин, заснований на їх взаємодії з сорбентами.Сорбенти - це те, що може ввібрати в себеінші хімічні речовини, і найпростіший - це активоване вугілля, яке ми приймаємо при отруєнні. На початку ХХ століття російський вчений Михайло Цвет продемонстрував, що якщо такий природний барвник пропустити через колонку, заповнену крейдою, то замість однієї великої зеленої розмазаної плями вийде кілька різнокольорових плям: від жовтої до зеленої. Тим самим він, по-перше, зрозумів, що зелений барвник із листя — це суміш різних речовин. А по-друге, відкрив хроматографію, за яку 1952 року вже іншим вченим, які довели його метод до деякого сучасного вигляду, присудили Нобелівську премію. У сучасній хроматографії суміш проходить через колонку за допомогою рідини чи газу залежно від типу хроматографії. Рідина "тягне" молекули вперед, до виходу з колонки, а сорбент заважає кожній молекулі по-різному. У результаті вони виходять із колонки у різний час, який можна зафіксувати та використовувати як ще один відбиток для ідентифікації.
Від дослідження спинномозкової рідини до методу сухої крові
Метод мас-спектрометрії - це єдино придатний на сьогодні метод вивчення спинномозкової рідини.У деяких складних випадках для діагностикизахворювань потрібно пункція, проколюється хребет і відбирається зразок спинномозкової рідини. Але проблема в тому, що спинномозкова рідина у людини в середньому всього 120 мл. І ця рідина знаходиться під тиском, тому відбір навіть 1 мл істотно впливає на цей тиск і може призвести до незворотних наслідків для організму. Тому відібрати насправді можна лише кілька мікролітрів. Жоден з існуючих методів, крім мас-спектрометрії, не може працювати з такими маленькими кількостями зразків, тому що чим менше зразок, тим менше у нього молекул і тим чутливішим має бути ваше обладнання. Чутливості мас-спектрометрії зазвичай цього вистачає. Після забору зразок позбавляють механічних включень та білків, щоб уникнути поломок приладів. Після аналізу результат обробляють за допомогою комп'ютера та одержують «список ознак»: на виході це приблизно 10–15 тис. рядків. У стовпцях виходить формула, яку визначаємо з точної масою, інтенсивність, яка пропорційна кількості цієї молекули, і «відбитки пальців».
Найбільш прямий метод застосування такогометаболомного мас-спектрометричного експерименту — порівняння хворих та здорових людей для виявлення того, які молекули проявляються, з'являються та змінюють свою концентрацію при виникненні такої різниці.Зазвичай беруть дві групи:людей здорових і людей із захворюванням, які нас цікавлять, наприклад, з якоюсь конкретною формою онкології. Для кожного зразка одержують такі таблички, а далі математики порівнюють та візуалізують їх, щоб знайти між ними відмінності.
Перша сфера застосування мас-спектрометрії - це неонатальний скринінг.Кожного новонародженого, за наказом МОЗ з2006 року обов'язково тестують на певний набір спадкових захворювань. Зараз, принаймні, у Москві тестують щонайменше на 16 різних хвороб. Є такі захворювання, і вони часто проявляються прямо з перших хвилин життя, які якщо вчасно не купірувати, через тиждень чи кілька днів можуть зробити дитину інвалідом на все життя. Тому таку діагностику необхідно проводити протягом перших перших годин життя новонародженого. Біомаркерами всіх цих захворювань є малі молекули-метаболіти. Тобто хвороби виявляються у вигляді збоїв у метаболізмі, наприклад, накопиченні певних органічних кислот у крові чи деяких ліпідів. І, природно, це накопичення відбувається у дуже невеликих концентраціях, за ними необхідно розпізнати різницю у зміні метаболізму. Тому, крім мас-спектрометрії, тут жодного іншого методу не працюватиме.
Щоб вирішити проблему із забором крові у дітей (не така велика кількість крові та страх дітей перед інвазивними методами та лікарями), вигадали технологію аналізу сухих плям крові.Робиться маленький прокол, і відбирається одна чидві краплі крові прямо на невеликий шматочок фільтрувального паперу. Обсяг крові тут – кілька мікролітрів. Потім ця картка висушується і вирушає до лабораторії, причому відправлення відбувається теж дуже зручно: зразок не треба ні заморожувати, ні розморожувати. Просто перерозчинити цю картку, і аналіз, і протягом кількох годин аналіз готовий.
Ще одна сфера застосування мас-спектрометрії - персоналізована медицина.У нас всі речовини потрапляють у печінку, і печінкуїх якось метаболізує. Причому печінка у всіх у нас працює по-різному не лише через якісь захворювання чи шкідливі звички. Наприклад, на метаболізм може суттєво вплинути грейпфрутовий сік, він інгібує деякі ферменти і в результаті концентрація деяких ліків у вас може виявитися у кілька разів вищою від очікуваного. У деяких людей після прийому препарату концентрація в крові буде такою, а в інших — удвічі вищою. Виходить, що дозування потрібно зменшувати вдвічі, щоб не завдавати зайвої шкоди організму. Звідси і перехід до персоналізованої медицини. Ви п'єте пігулку, у вас відбирають кров щогодини і дивляться криву: як у вас речовина подорожує з часом по організму, яка у нього концентрація в крові. Далі лікар може дозування скоригувати або взагалі скасувати препарат і призначити інший. І ось у цьому випадку також дуже активно застосовується аналіз сухої крові.
Будь-які нові ліки, що виходять на ринок, обов'язково проходять стадію досліджень метаболізму.Деякі ліки можуть бути не дуже токсичні,Проте в результаті розпаду в печінці та деяких помилок ці речовини можуть перетворюватися навіть на більш токсичні. Найпростіший приклад – це парацетамол. В інструкції до парацетамолу сказано, що заборонено давати маленьким дітям. Що маленьким дітям потрібно давати лише ібупрофен. А причина тому — накопичення цієї молекули в печінці, в результаті метаболізму яка має токсичний ефект. Для дорослої людини з її добре розвиненою печінкою цей токсичний ефект він не дуже помітний, хоча, звичайно, ковтати парацетамол банками теж не можна. То для маленьких дітей це насправді може призвести до всяких неприємних і навіть незворотних наслідків. Тому кожні нові ліки обов'язково вивчаються на метаболізм.
Імаджинг – це спосіб проведеннямас-спектрометричного аналізу, коли ми отримуємо інформацію не тільки про гомогенний, а й про гетерогенний зразок, причому ми можемо вивчити його молекулярний склад у просторі.Є такий цікавий приклад з вивченнярозподілу лікарського засобу і його метаболітів в організмі щура. Експеримент проводиться так: щура дають якісь ліки, після декількох годин тварина піддають евтаназії і далі тварина тонко-тонко нарізаються уздовж всього тіла. А потім спеціальна техніка мас-спектрометрії дозволяє вивчити молекулярний склад кожної точки цього зразка. Після комп'ютерної обробки можна візуалізувати, де які метаболіти накопичилися. Важливо вивчати розподіл метаболітів, тому що якщо ви приймаєте препарат від пневмонії, важливо, щоб він виявився в легких, а не в мозку. Мас-спектрометричний скальпель - це «ніж», який відкачує молекули з місця розрізу, а потім за допомогою комп'ютерних технологій можна визначити, яку хірург ріже тканину: хвору або здорову. Цей метод зараз впроваджується в США, і вже проведена була перша реальна операція таким ножем.
«Відбитки пальців» для кожної молекули
Проблема в тому, що одному елементного складу може відповідати кілька сотень або навіть тисяч хімічних сполук.Тому необхідно ідентифікувати усі рядкитаблиці, і це основне завдання сучасного метаболомного аналізу, вона, на жаль, остаточно не вирішена. Молекулярні відбитки порівнюються з тими, що є у базах даних хімічних молекул. Якщо вони збігаються, значить, ми можемо певною мірою говорити, що це потрібна молекула. Але у таких базах даних дуже обмежена кількість речовин. Повна база відбитків містить близько 20-30 тисяч сполук, вона навіть не покриває всі первинні і вторинні метаболіти, які є в організмі людини. Є ще одна проблема: щоб цю базу даних поповнити, потрібна чиста хімічна речовина, а вони зазвичай дорогі. Тобто одна хімічна чиста речовина коштує зазвичай кілька десятків або сотень доларів.
Один із підходів до ідентифікації — це створення нових відбитків пальців.Наприклад, зараз дуже активно розвивається методспектрометрії іонної рухливості Якщо мас-спектрометрія ділить іони масою, то іонна рухливість дозволяє розділити їх за розміром. Тобто якщо у вас є два бігуни - не важкий і легкий, а великий і дрібний, і на їхньому шляху поставити якусь перешкоду - наприклад, сітку з осередками, то стрункий атлет швидко через цю сітку пролізе і до фінішу добіжить, а повний поки виплутається з цієї мережі, прибіжить через якийсь час.
Другий метод - це спроба знайти такі відбитки пальців, для визначення яких не потрібні чисті стандарти.Ми пропонуємо в лабораторії використовувати так званий ізотопний обмін.
Наприклад, якщо ми подивимося на таку молекулу, топобачимо, що у неї є атоми водню, пов'язані з киснем. Так ось, вони - особливі. Вони можуть цю молекулу залишати і до неї повертатися. Якщо у нас ця молекула розчинена у воді, то піти може водень з молекули, а повернутися водень із води. А якщо ми візьмемо не просто воду, а важку, де замість водню дейтерій, то водень з молекули може піти, а на його місце може стати дейтерій. Дейтерій, як відомо, відрізняється від водню з молекулярної масі на одиницю, і мас-спектрометр може таке зрушення побачити. Просто порахувавши кількість таких ось відрядив, можна сказати, потрібна це молекула або непотрібна, правильно ми її ідентифікували чи ні.
Для ідентифікації молекул можна застосовувати штучний інтелект.На основі наявної інформації можна добудуватибази даних недостатньою інформацією з допомогою методів глибинного навчання. Тобто ми навчаємо модель, і вона за структурою молекули передбачає необхідні відбитки, які далі ми можемо використовувати для порівняння з тим, що отримано в експерименті.
Читайте також:
Уран отримав статус самої дивної планети в Сонячній системі. Чому?
Люди можуть витримувати дуже низькі температури навіть без джерел тепла
Фізики створили аналог чорної діри і підтвердили теорію Хокінга. До чого це призведе?