Skoltechs masspektrometrilaboratorium leds av en motsvarande medlem av den ryska vetenskapsakademin
Det som ligger i hjärtat av att bygga livsprocesser
DNA är en lång polymerkedja som lagrar information om hur kroppen ska se ut och fungera.Det vill säga hur vi skiljer oss från andra arteroch hur två individer av samma art skiljer sig från varandra. Dessa molekyler bestämmer vår unikhet. Låt mig ge dig ett exempel: en larv och fjärilen som den växer in i. Tror du att deras DNA-molekyler är olika eller lika? Faktum är att det korrekta svaret är: detsamma. Genetisk information förändras inte på något sätt under livet. Egentligen, varför är larver och fjärilar olika i slutändan? För inte all information som lagras i DNA realiseras samtidigt. Implementering sker genom transkriptionsprocessen, som ett resultat av vilket budbärar-RNA, efter att ha läst individuella gener, tillåter syntes av proteiner.
Proteiner är universella molekylära maskiner i vår kropp som utför olika funktioner: från konstruktion till reglerande.En av de förlegade definitionerna av liv ärordnad existens och interaktion av proteinmolekyler. Men problemet är att proteinmolekyler också är stora. Proteiner är också polymermolekyler med stor molekylvikt: vanligtvis från 10 till flera hundra kilodalton. Och att bygga grundläggande livsprocesser på dem är ganska problematiskt, eftersom de är ganska känsliga för förändringar i temperatur och den yttre miljön. Och det är förmodligen därför nästan alla vitala processer i en cell realiseras genom små molekyler. Och omvandlingen av små molekyler till varandra styrs redan av proteiner. Molekylvikten för dessa små molekyler är från flera tiotal till flera hundra kilodalton. Alla små molekyler som finns i en levande organism kallas metaboliter.
1 dalton eller 1 atommasseenhet (amu)- en massenhet utanför systemet som används för massor av molekyler, atomer, atomkärnor och elementarpartiklar.
1 a. enheter = 1.660 539066 60 (50) ⋅10−27 kg.
Primära metaboliter är kemikalier som finns i alla celler i kroppen och är nödvändiga för att upprätthålla vitala processer.Alla polymermolekyler, proteiner ochnukleinsyror. Dessa metaboliter är desamma för alla celler i en organism. Under livet omvandlas metaboliter till varandra, till exempel i syfte att överföra energi. Och dessa transformationsvägar – transformationskedjor – kallas metaboliska vägar.
Krebs-cykeln, eller trikarboxylsyra-cykeln, är ansvarig för processen för cellulär andning.
Olika metaboliska vägar i människokroppen skär varandra, det vill säga de har gemensamma deltagare.Således är alla processer som sker med metaboliter sammankopplade.
Sekundära metaboliter är ämnen som inte är nödvändiga för alla celler för att säkerställa deras vitala funktioner.De används vanligtvis för att anpassa sig till förhållandenayttre miljön. Till exempel producerar kaffeväxter koffein för att skydda sina blad från skadedjur. De är giftiga för skalbaggar som äter bladen från kaffeväxter. Men om vi på något sätt tar bort allt koffein från växten kommer den att fortsätta leva. Inga vitala processer kommer att störas. Det andra exemplet är antibiotika. Du vet att penicillin är det första antibiotikumet, och det isolerades helt av misstag från mögelsvampar, vilket revolutionerade medicinen. Mögelsvampar använder penicillin för att rensa sitt livsrum. Det är ofarligt för moderorganismen, men giftigt för andra mikroorganismer. Faktum är att människor använder denna egenskap för att behandla olika bakterieinfektioner. På grund av det faktum att människor aktivt konsumerar växter som mat, är vår kropp tätt befolkad med olika mikroorganismer som bildar mikroflora. Dessa ämnen är sekundära metaboliter, inte bara av personen själv, utan också av levande organismer som oundvikligen kommer in i vår kropp.
Det naturliga filtret och varför det är fel
Xenometaboliter är antibiotika, föreningar som inte är förknippade med aktiva levande organismer.Det är oftast något som en person har fåttartificiellt för olika ändamål. Till exempel läkemedel, livsmedelstillsatser, kosttillskott, dopning, droger, tobaksförbränningsprodukter, alkohol eller hygienprodukter, hushållskemikalier, ekotoxiska medel. Dessa är också små molekyler, och de kommer in i kroppen både avsiktligt, när det gäller droger, och av misstag. Till exempel borstade du tänderna, svalde tandkräm – och det var så nya kemikalier kom in i ditt system. Och många av dessa ämnen kan ha vissa effekter på vår kropp, även i mycket små koncentrationer. Dessutom kan denna effekt vara antingen positiv eller negativ eller variera beroende på mängden av detta ämne.
Levern är den första barriären mot främmande kemikaliers inträde i systemcirkulationen.Den försöker filtrera bort molekyler somkroppen kommer att skadas och ta bort dem, vilket förhindrar att de släpps vidare genom blodomloppet in i organen. Levern har många filtreringsmekanismer, men ingen av dem fungerar till 100 %: annars skulle det inte bli någon förgiftning och allvarliga konsekvenser av att ta några gifter eller droger. Däremot utnyttjar levern det faktum att vår kropp till stor del är vatten, det vill säga den består av 80 procent vatten. Därför försöker levern sortera molekylerna i hydrofila, som löser sig i vatten, och hydrofoba. Levern "tror" att om ämnet är hydrofilt kan det släppas ut ytterligare i den systemiska cirkulationen, eftersom det inte borde orsaka mycket skada. Och om ett ämne är hydrofobt så måste något göras med det för att förhindra att det frigörs ytterligare eller åtminstone göra det mer hydrofilt.
Levern har två mekanismer - metaboliska faser.I den första fasen försöker levern attspeciella proteiner och enzymer från cytokrom P450-familjen oxiderar dessa ämnen. Som ett resultat av oxidation förändras molekylens struktur och den kan bli mer hydrofil. Levern kan sedan släppa ut dessa metaboliter i blodomloppet eller försöka ta bort dem genom njurarna genom urin eller genom tarmarna. Om detta inte fungerar kan levern "sy" färdiga, garanterat vattenlösliga molekyler på dessa oxiderade molekyler.
Levermetabolismen ökar mångfalden av små molekyler som kan hamna i våra kroppar.Till exempel i oxidationsstadiet bildas teoretiskt mer än 500 olika nya andra molekyler från en molekyl; det är inte möjligt att förutsäga vilka av dem som bildas och vilka inte.
Det oändliga alfabetet: Varför det är så svårt att studera metaboliter
Nukleinsyror kan representeras som ett alfabet med fem bokstäver från vilket en stor textsträng är konstruerad.Ja, naturligtvis, sekvensen av bokstäver i dettalinje kan vara relativt kaotisk, även om DNA:t under livet inte förändras, utan bara kopieras. Så vi har vissa begränsningar för vad denna sträng kommer att vara. När det gäller proteiner är situationen något mer komplicerad: det kommer redan att finnas 20 bokstäver i alfabetet, det vill säga 20 aminosyror som proteiner är uppbyggda av, men detta sker också ofrivilligt. Därför, från forskarens synvinkel, är dessa föremål också ganska lika varandra. Och när det gäller metaboliter är det extremt problematiskt att peka ut vilket alfabet som helst: i själva verket är detta hela det periodiska systemet. Och bland bildningsreglerna - bara valensregeln. Dessutom finns det en egenskap hos kolkemin som gör att två kolatomer kan binda till varandra och sedan lägga till ett obegränsat antal kolatomer eller andra atomer från det periodiska systemet, vilket ger upphov till en enorm kemisk mångfald av sådana molekyler.
För att studera sådana små molekyler och all deras variation krävs särskilda metoder.Det finns enkla sådana:till exempel en organoleptisk analys, som alla som har tagit ett allmänt blod- eller urinprov och sett att det finns en linje ”lukt, färg” i riktningen har stött på. När det är nödvändigt att hitta en specifik molekyl i en lösning tillsätts en droppe av ett förvalt reagens. Om det fanns en molekyl i lösningen kommer färgning att ske, om den inte var det kommer bara en fällning att uppstå. Bland de enkla metoderna finns också optisk spektroskopi, då man med mikroskop kan dra slutsatser av sedimentets struktur. Ganska populära nu är immunkemiska metoder: detta är samma ELISA-test för COVID-19.
Omics-studier är de studier som studerar en komplett population.Och metabolomics innebär analys av storadata som representerar den kompletta uppsättningen små molekyler i en organism, cell eller organ. Uppsättningen av dessa data varierar enligt olika uppskattningar från flera tusen, om vi bara tar hänsyn till de primära metaboliterna, till flera tiotusentals, om vi lägger till sekundära metaboliter av kända växter, bakterier och svampar till dem. Faktum är att upp till flera hundra miljoner, om vi tar hänsyn till all kemisk mångfald som kan komma in i människokroppen. Och för att studera dem behövs speciella metoder: kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi och masspektrometri.
Under NMR: s 80-åriga historia har forskare som är involverade i denna metod fått fem Nobelpriser.Fyra - för NMR, och den femte - förmagnetisk resonanstomografi. En metod som skiljer sig något från NMR-spektroskopi, men väldigt lik i princip. NMR-metoden bygger på det faktum att vissa atomer i det periodiska systemet har ett magnetiskt moment som inte är noll. De är små magneter och kan interagera med ett externt magnetfält. Denna interaktion yttrar sig i splittringen av energinivåer. NMR-metoden gör att man kan skilja mellan olika atomer och atomer av samma grundämne, men i olika miljöer. På senare tid har NMR tappat i popularitet, främst på grund av dess höga kostnad.
Hur man gör laddade partiklar från en komplex blandning och ta reda på deras sammansättning
Masspektrometri är en metod för att separera laddade partiklar genom att interagera med ett elektromagnetiskt fält.Om vi tar någon komplex blandning bestående avolika laddade partiklar, och nästan vilken molekyl som helst med moderna masspektrometrimetoder kan omvandlas till en laddad form genom att lägga till en proton till den eller ta bort en proton från den, och applicera ett elektromagnetiskt fält på denna blandning, då kommer partiklarna i detta fält att börja att flytta och de kommer att ha antingen hastighet eller en bana beroende på massa. Lätta partiklar kommer till detektorn tidigare än tunga. Efter bearbetning av data från detektorn erhålls ett masspektrum, där det längs Y-axeln kommer att finnas signalintensitet, som är proportionell mot antalet joner, och längs X-axeln - massan i jonerna, eller snarare, förhållandet mellan massa och laddning. Dessutom låter masspektrometri dig mäta massa med mycket hög noggrannhet. Detta innebär att det är möjligt att entydigt fastställa grundämnessammansättningen av jonen, laddade partiklar eller molekyl som den bildades av. Matematiskt kallas detta att lösa den diofantiska ekvationen i heltal: i själva verket är detta ett urval av koefficienter nära varje atom: m(C), m(H), k(O), z(N). Och bara en kombination av heltal m, n, k, z kan ge massan som mäts av masspektrometern.
Metoden för masspektrometri föreslogs i början av 1900-talet av Thompson.Forskare satte ihop världens första masspektrometer ochmed sin hjälp gjorde han en stor upptäckt: han bekräftade experimentellt existensen av isotoper. Å andra sidan kunde han inte ge en korrekt tolkning av sina resultat. Hans elev William Aston gjorde detta åt honom: 1922 fick han Nobelpriset för denna upptäckt. På 1900-talet, på grund av en rad världskrig, utvecklades masspektrometri som en metod för militären. I början av sin utveckling hittade den sin huvudsakliga tillämpning inom kärnkraftsindustrin. Eftersom masspektrometri kan separera ämnen efter massa och bestämma isotoper, kan den användas för att separera isotoper som uran. Ytterligare två Nobelpriser delades ut för masspektrometri: 1989 - Wolfgang Paul och Hans Dehmelt, och sedan 2002 - en verklig revolution genomfördes oberoende av John Fenn och Kaishi Tanaka. De föreslog en egen metod som gör det möjligt att få en laddad partikel från en stor polymermolekyl: från proteiner eller från nukleinsyror, utan att förstöra den. Detta satte fart på studien. Nu kan inte ett enda laboratorium - biokemiskt eller molekylärbiologiskt laboratorium - fungera utan en egen masspektrometer eller utan ett välutrustat gemensamt brukscenter vid institutet.
Определив массу иона, мы можем определить только элементный состав, но не структуру молекул.Eftersom en elementarsammansättning av olika strukturer kan motsvara ett stort antal. Det vill säga att atomerna i en molekyl kan ordnas på olika sätt. Detta kallas fenomenet isomerism.
Masspektrometrister har kommit fram till en metod som gör att du kan få lite mer information om strukturen för en molekyl: ett visst hinder placeras i vägen för flygande accelererade molekyler.Vanligtvis är dessa gasmolekyler.När molekylerna kolliderar med dessa gasmolekyler kan de bryta isär från kollisionen. Och sedan mäter masspektrometern massan inte av den ursprungliga molekylen, utan av de bitar som den bröts upp i. Och detta sönderfall sker inte slumpmässigt, utan längs de svagaste bindningarna i molekylen. De resulterande fragmenten är identiska och de är molekylära fingeravtryck: unika för varje molekyl.
Kromatografi är en metod för att separera ämnen baserat på deras interaktion med sorbenter.Sorbenter är något som kan absorberaandra kemikalier, och det enklaste är aktivt kol, som vi tar vid förgiftning. I början av 1900-talet visade den ryske forskaren Mikhail Tsvet att om ett sådant naturligt färgämne passeras genom en kolonn fylld med krita, kommer du istället för en stor grön utsmetad fläck att få flera flerfärgade fläckar: från gul till grön. Således insåg han för det första att det gröna färgämnet från bladen är en blandning av olika ämnen. Och för det andra upptäckte han kromatografi, för vilken 1952 andra vetenskapsmän som förde hans metod till någon modern form tilldelades Nobelpriset. I modern kromatografi passerar en blandning genom en kolonn med hjälp av en vätska eller gas, beroende på typen av kromatografi. Vätskan "drar" molekylerna framåt, mot utgången av kolonnen, och sorbenten stör varje molekyl på olika sätt. Det slutar med att de lämnar kolumnen vid olika tidpunkter, vilket kan spelas in och användas som ytterligare ett fingeravtryck för identifiering.
Från undersökning av cerebrospinalvätska till torrblodmetod
Masspektrometri är den enda metod som för närvarande finns tillgänglig för att studera cerebrospinalvätska.I vissa svåra fall för diagnossjukdomar, en punktering krävs, ryggraden genomborras och ett prov av cerebrospinalvätska tas. Men problemet är att en person i genomsnitt bara har 120 ml cerebrospinalvätska. Och denna vätska är under tryck, så att ta till och med 1 ml påverkar detta tryck avsevärt och kan leda till oåterkalleliga konsekvenser för kroppen. Därför kan i verkligheten endast ett fåtal mikroliter tas. Ingen av de befintliga metoderna förutom masspektrometri kan hantera så små mängder prover, för ju mindre provet är, desto färre molekyler har det och desto känsligare behöver din utrustning vara. Masspektrometrins känslighet är vanligtvis tillräcklig för detta. Efter insamling tas provet bort från mekaniska inneslutningar och proteiner för att undvika att utrustningen går sönder. Efter analys bearbetas resultatet med hjälp av en dator och en "lista över funktioner" erhålls: utmatningen är cirka 10–15 tusen rader. Kolumnerna producerar en formel som vi definierar med en exakt massa, en intensitet som är proportionell mot mängden av den molekylen och ett "fingeravtryck".
Den mest direkta metoden för att tillämpa dettametabolomics masspektrometriexperiment - jämför sjuka och friska människor för att identifiera vilka molekyler som dyker upp, dyker upp och ändrar deras koncentration när en sådan skillnad uppstår.Vanligtvis finns det två grupper:friska människor och personer med en sjukdom som är intressant för oss, till exempel med en specifik form av onkologi. För varje prov erhålls sådana plattor, och sedan jämför och visualiserar matematiker dem för att hitta skillnader mellan dem.
Den första tillämpningen av masspektrometri är vid neonatal screening.Varje nyfödd, på order av hälsoministeriet med2006 måste de testa för en viss uppsättning ärftliga sjukdomar. Nu testar man i alla fall i Moskva för minst 16 olika sjukdomar. Det finns sådana sjukdomar, och de manifesterar sig ofta redan från de första minuterna av livet, som, om de inte stoppas i tid, om en vecka eller några dagar kan göra barnet handikappat för livet. Därför måste sådan diagnostik göras inom de första timmarna av en nyfödds liv. Biomarkörerna för nästan alla dessa sjukdomar är småmolekylära metaboliter. Det vill säga sjukdomar visar sig i form av störningar i ämnesomsättningen, till exempel ackumulering av vissa organiska syror i blodet eller vissa lipider. Och naturligtvis sker denna ackumulering i mycket små koncentrationer; från dem är det nödvändigt att känna igen skillnaden i förändringar i metabolism. Därför, förutom masspektrometri, kommer ingen annan metod att fungera här.
För att lösa problemet med att samla in blod från barn (inte så stor mängd blod och barns rädsla för invasiva metoder och läkare), kom de med en teknik för att analysera torkade blodfläckar.En liten punktering görs och en eller fleratvå droppar blod direkt på en liten bit filterpapper. Volymen blod här är flera mikroliter. Sedan torkas detta kort och skickas till laboratoriet, och sändningen är också mycket bekväm: provet behöver inte frysas eller tinas. Lös bara upp det här kortet igen för analys, och inom några timmar är analysen klar.
Ett annat användningsområde för masspektrometri är personlig medicin.Alla våra ämnen går till levern och levernpå något sätt metaboliserar dem. Dessutom fungerar våra lever olika för oss alla, inte bara på grund av vissa sjukdomar eller dåliga vanor. Till exempel kan grapefruktjuice avsevärt påverka din ämnesomsättning, det hämmar vissa enzymer och som ett resultat kan din koncentration av vissa läkemedel vara flera gånger högre än förväntat. Vissa människor kommer att ha denna koncentration i blodet efter att ha tagit läkemedlet, medan andra kommer att ha dubbelt så hög koncentration. Det visar sig att dosen måste halveras för att inte orsaka onödig skada på kroppen. Därav övergången till personlig medicin. Du tar ett piller, ditt blod tas varje timme och de tittar på kurvan: hur ämnet färdas genom din kropp över tiden, vilken koncentration har det i blodet. Då kan läkaren justera dosen eller till och med stoppa läkemedlet åt dig och ordinera ett annat. Och i det här fallet används torrblodanalys också mycket aktivt.
Varje nytt läkemedel som kommer in på marknaden går nödvändigtvis igenom ett metaboliskt forskningsstadium.Vissa läkemedel kanske inte är särskilt giftiga,men som ett resultat av nedbrytning i levern och vissa fel, kan dessa ämnen förvandlas till ännu mer giftiga. Det enklaste exemplet är paracetamol. Instruktionerna för paracetamol säger att det inte ska ges till små barn. Att små barn endast ska ges ibuprofen. Och anledningen till detta är ackumuleringen av denna molekyl i levern, som, som ett resultat av metabolism, har en toxisk effekt. För en vuxen med en välutvecklad lever är denna toxiska effekt inte särskilt märkbar, även om man förstås inte heller ska svälja paracetamol i burkar. För små barn kan detta faktiskt leda till alla möjliga obehagliga och till och med oåterkalleliga konsekvenser. Därför måste varje nytt läkemedel studeras för ämnesomsättning.
Imaging är ett sätt att bedrivamasspektrometrisk analys, när vi får information inte bara om ett homogent, utan också om ett heterogent prov, och vi kan studera dess molekylära sammansättning i rymden.Det finns ett så intressant exempel för studierdistribution av läkemedlet och dess metaboliter i råttans kropp. Experimentet utförs enligt följande: en råtta får ett visst läkemedel, efter några timmar avlivas djuret och därefter skärs djuret fint längs hela kroppen. Och sedan låter en speciell teknik för masspektrometri dig studera den molekylära sammansättningen för varje punkt i detta prov. Efter datorbearbetning är det möjligt att visualisera var vilka metaboliter har ackumulerats. Det är viktigt att studera fördelningen av metaboliter, för om du tar ett läkemedel mot lunginflammation är det viktigt att det hamnar i lungorna och inte i hjärnan. En masspektrometrisk skalpell är en "kniv" som pumpar molekyler ut ur snittplatsen och sedan, med hjälp av datorteknik, är det möjligt att bestämma vilken kirurg som skär vävnaden: sjuk eller frisk. Denna metod implementeras nu i USA, och den första verkliga operationen med en sådan kniv har redan genomförts.
Fingeravtryck för varje molekyl
Problemet är att flera hundra eller till och med tusentals kemiska föreningar kan motsvara en grundkomposition.Därför är det nödvändigt att identifiera alla radertabeller, och detta är huvuduppgiften för modern metabolomisk analys; tyvärr har den inte lösts helt. De molekylära fingeravtrycken jämförs med de som finns i databaser över kemiska molekyler. Om de matchar kan vi med viss säkerhet säga att det här är rätt molekyl. Men sådana databaser innehåller ett mycket begränsat antal ämnen. Den kompletta fingeravtrycksdatabasen innehåller cirka 20–30 tusen föreningar; den täcker inte ens alla primära och sekundära metaboliter som finns i människokroppen. Det finns ett annat problem: för att fylla på denna databas behöver du en ren kemisk substans, och de är vanligtvis dyra. Det vill säga, en ren kemikalie kostar vanligtvis flera tiotals eller hundratals dollar.
Ett sätt att identifiera är att skapa nya fingeravtryck.Till exempel utvecklas metoden nu aktivtjonmobilitetsspektrometri. Medan masspektrometri delar joner efter massa, tillåter jonmobilitet dem att separeras efter storlek. Det vill säga, om du har två löpare - inte en tung och en lätt, utan en stor och en liten, och lägger något slags hinder på vägen - till exempel ett nät med celler, då kommer en smal atlet krypa snabbt genom detta nät och nå mållinjen, men en tjock kommer tills han kommer ut ur detta nätverk, kommer han springande efter en tid.
Den andra metoden är att försöka hitta fingeravtryck som inte kräver rena standarder för att identifiera.I laboratoriet föreslår vi att använda det så kallade isotopbytet.
Om vi till exempel tittar på en sådan molekyl, dåvi kommer att se att den har väteatomer associerade med syre. Så de är speciella. De kan lämna denna molekyl och återvända till den. Om vi har denna molekyl upplöst i vatten kan väte lämna molekylen och väte kan återvända från vatten. Och om vi inte bara tar vatten, utan tungt vatten, där det i stället för väte finns deuterium, kan väte lämna molekylen och deuterium kan ta sin plats. Deuterium är känt för att skilja sig från väte i molekylvikt per enhet, och en masspektrometer kan se en sådan förskjutning. Helt enkelt genom att räkna antalet sådana väten kan vi säga om detta är en nödvändig eller onödig molekyl, om vi identifierade den korrekt eller inte.
Artificiell intelligens kan användas för att identifiera molekyler.Baserat på tillgänglig information kan du slutföradatabaser med saknad information med hjälp av metoder för djupinlärning. Det vill säga att vi tränar modellen, och den förutsäger nödvändiga fingeravtryck utifrån molekylens struktur, som vi sedan kan använda för att jämföra med vad som erhölls i experimentet.
Se även:
Uranus har fått status som den konstigaste planeten i solsystemet. Varför?
Människor tål mycket låga temperaturer även utan värmekällor
Fysiker har skapat en analog av ett svart hål och bekräftat Hawkings teori. Vart leder det?